Summary

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

Published: June 01, 2010
doi:

Summary

Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos T<em> In vitro</em>.

Abstract

A migração de linfócitos T envolve a interação adesivo de integrinas da superfície celular com ligantes expressos em outras células ou com proteínas da matriz extracelular. A ativação das integrinas preciso espaço-temporal de um estado de baixa afinidade para um estado de alta afinidade no limite da célula líder é importante para a migração de linfócitos T<sup> 1</sup>. Da mesma forma, a retração da borda das células à direita, ou uropod, é um passo necessário na manutenção persistente integrina-dependente motilidade linfócitos T<sup> 2</sup>. Muitas abordagens terapêuticas para auto-imunes ou inflamatórias integrinas doenças-alvo, como forma de inibir o recrutamento excessivo e migração dos leucócitos<sup> 3</sup>. Para estudar os eventos moleculares que regulam a migração de linfócitos T humanos, nós utilizamos um<em> In vitro</em> Sistema para analisar a migração de células em um substrato bidimensional que imita o ambiente que um linfócito T encontra durante o recrutamento da vasculatura. Linfócitos T são os primeiros isolados de doadores humanos e são, então, estimulado e cultivado por sete a dez dias. Durante o ensaio, os linfócitos T estão autorizados a aderir e migrar sobre um substrato revestido com uma molécula de adesão intercelular (ICAM-1), um ligante de integrina LFA-1, eo fator-1 de células derivadas do estroma (SDF-1). Nossos dados mostram que os linfócitos T apresentam uma velocidade de migração de ~ 15 mm / min. Migração de linfócitos T podem ser inibidos pelo bloqueio integrina<sup> 1</sup> Ou por inibidores da máquina actomyosin celular que regula a migração celular<sup> 2</sup>.

Protocol

1. Isolamento de linfócitos T humanos Obter sangue humano a partir de um doador saudável. Permitir que o sangue esfriar até a temperatura ambiente (~ 30 min) antes de prosseguir para a próxima etapa. Suavemente pipeta de 3 mL de temperatura ambiente Polymorph media gradiente de densidade em um tubo de poliestireno 8 mL de fundo redondo. Delicadamente adicionar 3 mL de sangue total em cima da mídia Polymorph. É importante evitar a mistura dos dois reagentes. Centrifugar os tubos a 500…

Discussion

Neste experimento, nós fornecemos detalhes sobre um sistema simples para analisar a motilidade do principal linfócitos T humanos. Ensaios de migração in vitro têm sido usadas para dissecar os papéis de muitas moléculas e vias de sinalização envolvidas na locomoção de vários tipos de células. Alguns controles fundamentais para manter em mente ao projetar sua própria experiência de nosso protocolo incluem: 1) não-adesiva ou não-integrina revestimentos adesivos, substratos tais como album…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este projecto foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants HL087088 (MK) e HL18208 (MK).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
RPMI 1640   Gibco 11875  
FBS   Thermo Scientific SH300070.03  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
1-Step Polymorphs   Accurate Chemical AN221725  
PHA   Remel/Fisher Scientific R30852801  
Rec. human IL-2   R&D Systems 202-IL  
Rec. human IL-15   R&D Systems 247-IL  
Protein G   Sigma Aldrich 19459  
Rec. human ICAM-1/Fc   R&D Systems 720-IC  
Rec. human SDF-1   R&D Systems 350-NS  

References

  1. Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
  2. Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
  3. Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).

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Cite This Article
Lefort, C. T., Kim, M. Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro. J. Vis. Exp. (40), e2017, doi:10.3791/2017 (2010).

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