Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em
Summary
T-Lymphozyten-Migration tritt bei der Referenzfahrt zu lymphatischen Organen, Ausfahrt aus dem Gefäßsystem, und das Eintreten in den peripheren Geweben. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden, um T-Lymphozyten-Migration zu analysieren lassen<em> In-vitro-</em>.
Abstract
Die Migration von T-Lymphozyten besteht der Klebstoff Wechselwirkung von Zelloberflächen Integrine mit Liganden auf anderen Zellen oder mit der extrazellulären Matrix exprimiert. Die genaue raumzeitliche Aktivierung der Integrine aus einer geringen Affinität Zustand in einen Zustand hoher Affinität an die Zelle Vorderkante ist für T-Lymphozyten-Migration wichtige<sup> 1</sup>. Ebenso Zurückziehen der Zelle Hinterkante oder uropod, ist ein notwendiger Schritt bei der Aufrechterhaltung persistent Integrin-abhängigen T-Lymphozyten-Motilität<sup> 2</sup>. Viele Therapieansätze für Autoimmun-und entzündlichen Erkrankungen Ziel Integrine als ein Mittel zur Hemmung der übermäßige Rekrutierung und Migration von Leukozyten<sup> 3</sup>. Zur Untersuchung der molekularen Vorgänge, die menschlichen T-Lymphozyten-Migration zu regulieren, haben wir eine genutzt<em> In-vitro-</em> System Zellwanderung auf einer zweidimensionalen Substrat, das die Umgebung, die eine T-Lymphozyten Begegnungen bei der Einstellung aus dem Gefäßsystem imitiert zu analysieren. T-Lymphozyten sind zuerst von menschlichen Spendern isoliert und anschließend angeregt und kultiviert 7-10 Tage. Während des Tests sind T-Lymphozyten erlaubt, festhalten und auf einem Substrat mit ICAM-1 (ICAM-1), einem Liganden für Integrin LFA-1, und Stromazellen cell-derived factor-1 (SDF-1) beschichtet migrieren. Unsere Daten zeigen, dass T-Lymphozyten eine wandernde Geschwindigkeit von ca. 15 mu m / min aufweisen. T-Lymphozyten-Migration kann durch Integrin-Blockade gehemmt werden<sup> 1</sup> Oder durch Inhibitoren des zellulären Actomyosin Maschinen, regelt die Zellwanderung<sup> 2</sup>.
Protocol
Discussion
In diesem Experiment, bieten wir Informationen über ein einfaches System, um die Beweglichkeit der primären menschlichen T-Lymphozyten zu analysieren. In-vitro-Assays Migration wurden verwendet, um die Rollen von vielen Molekülen und Signalwege in der Fortbewegung verschiedener Zelltypen beteiligt zu sezieren. Einige kritische Steuerungen im Auge zu behalten, wenn die Gestaltung Ihrer eigenen Experiment aus unserem Protokoll gehören: 1) Non-Klebstoff oder Nicht-Integrin-Haftgrund Beschichtungen, wie Rinders…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von den National Institutes of Health Grants HL087088 (MK) und HL18208 (MK) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Gibco | 11875 | ||
| FBS | Thermo Scientific | SH300070.03 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical | AN221725 | ||
| PHA | Remel/Fisher Scientific | R30852801 | ||
| Rec. human IL-2 | R&D Systems | 202-IL | ||
| Rec. human IL-15 | R&D Systems | 247-IL | ||
| Protein G | Sigma Aldrich | 19459 | ||
| Rec. human ICAM-1/Fc | R&D Systems | 720-IC | ||
| Rec. human SDF-1 | R&D Systems | 350-NS |
References
- Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
- Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
- Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).
