RNAi Plating voor C. elegans Feeding: Een techniek om doel dsRNA expressie te induceren in E. coli

Published: April 30, 2023

Abstract

Bron: Kolundzic, E., et al. Toepassing van RNAi en heat-shock-geïnduceerde transcriptiefactorexpressie om kiemcellen te herprogrammeren op neuronen in C. elegansJ.Vis. Exp. (2018).

Deze video beschrijft de principes achter de RNAi-behandeling bij C. elegans en demonstreert een protocol om lin-35 in een transgene wormstam neer te slaan.

Protocol

Dit protocol is overgenomen uit Kolundzic, et al, Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018). Oplossingsvoorbereiding NGM-Agar platen (1 L) Voeg 3 g NaCl, 2,5 g pepton media (bijv. Bacto-Peptone) en 20 g agar toe…

Representative Results

Figuur 1: Pvul fenotype veroorzaakt door RNAi tegen lin-53. (Boven) DIC-beeld van L4/young adult stadium F1-nakomelingenwormen afgeleid van controle of lin-53 RNAi behandelde moeders. Schaalbalken = 20 μm. (Onder) Dieren behandeld met lin-53 RNAi geven het uitstekende vulva (pvul) fenotype (zwarte pijlpunten) weer. Het pvul fenotype bevestigt dat RNAi tegen lin-53<…

Materials

Chemicals 
Agar-Agar, Kobe I Roth 5210.1
Bactopeptone  A. Hartenstein GmbH 211 677 Peptone Media 
Yeast extract  AppliChem A1552,0100
Amphotericin B USBiological A2220
CaCl2 Merck Biosciences 208290
Cholesterol Roth 8866.2
Gelatine Roth 4275.3
IPTG Sigma 15502-10G
K2PO4 Roth T875.2
KH2PO4 Roth  3904.2
MgSO4 VWR 25,163,364
Na2HPO4 Roth P030.1
NaCl Roth 9265.1
NaClO Roth 9062.3
NaOH (5 N) Roth  KK71.1
Tris Roth AE15.2
Carbenicillin Roth 634412
Tetracycline Roth 2371.2
Incubators
Incubator  Sanyo MIR-5 5534210 for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope SMZ745 Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115 F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50  Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53 SourceBioscience ID I-4D14 Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440 Addgene  #1654

Play Video

Cite This Article
RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20138, doi: (2023).

View Video