我们描述了用小鼠大脑中表达荧光素酶 – 绿色荧光蛋白(GFP)的双报告载体转导的人神经祖细胞的实质内移植。移植后,使用荧光显微镜在脑切片 中鉴定的体内 生物发光和表达GFP的移植细胞反复测量荧光素酶信号。
细胞疗法长期以来一直是实验神经生物学中新兴的治疗范式。然而,细胞移植研究通常依赖于终点测量,因此只能在有限的程度上评估细胞迁移和存活的纵向变化。本文提供了一种可靠的微创方案,用于移植和纵向跟踪成年小鼠大脑中的神经祖细胞(NPC)。在移植之前,用包含生物发光(萤火虫 – 荧光素酶)和荧光(绿色荧光蛋白[GFP])报告基因的慢病毒载体转导细胞。NPC在感觉运动皮层中使用立体定向注射移植到右皮质半球。移植后,通过完整的颅骨检测移植细胞长达五周(在第0,3,14,21,35天),使用 体内 生物发光成像的分辨率限制为6,000个细胞。随后,在组织学脑切片中鉴定移植的细胞,并用免疫荧光进一步表征。因此,该协议为移植,跟踪,量化和表征小鼠大脑中的细胞提供了有价值的工具。
哺乳动物大脑在受伤或疾病后的再生能力有限,需要创新的策略来促进组织和功能修复。临床前策略侧重于脑再生的不同方面,包括神经保护,神经发生,血管生成1,2,血脑屏障修复3,4或细胞治疗5,6。细胞疗法的优点是能够同时促进许多这些促修复过程。在细胞移植实验中,组织修复是通过(1)直接细胞替代和(2)导致血管生成和神经发生的细胞因子的产生7发生的。干细胞技术的最新进展进一步促进了可扩展的,特征明确的神经细胞源的开发,这些神经细胞源现在正在进行临床试验(在 7,8,9中进行了审查)。虽然细胞疗法已经达到一些神经系统疾病(例如,帕金森病10,中风11和脊髓损伤12)的临床阶段,但它们的疗效一直各不相同,需要更多的临床前研究来了解移植物 – 宿主相互作用的机制。
许多临床前研究的一个主要限制是连续跟踪宿主内的移植细胞。通常只执行终点测量,省略了宿主6,13中的动态迁移和生存过程。这些局限性导致嫁接细胞的表征不佳,并且需要高动物数量来理解纵向变化。为了克服这些局限性,在这项研究中,我们用由红萤火虫荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白(rFluc-eGFP)组成的市售双报告慢病毒载体转导诱导诱导多能干细胞(iPSC)来源的神经祖细胞。这些细胞通过立体定位实质内注射移植到小鼠大脑中,并在5周内使用 体内 生物发光成像进行纵向跟踪。在收集脑组织后,鉴定表达GFP的移植细胞,并在组织学脑切片中进一步表征。该方法可以顺利地适应替代的可转导细胞源和移植途径,用于啮齿动物大脑的 体内 应用。总体而言,该程序对于获得小鼠大脑中移植物存活和迁移的纵向信息很有价值,并促进随后的组织学表征。
再生受伤的大脑以允许功能恢复仍然是一个未解决的挑战。许多创新的临床前方法已经进化出靶向,例如,免疫调节19,20,血管生成1,21,22,23,血脑屏障完整性2,3,24,25和细胞替代5,26.特别是近年来,由于干细胞技术和高效分化方案的重大进步,基于细胞的疗法已成为一种有前途的大脑治疗策略15,28。本文为移植和跟踪小鼠大脑中的神经细胞提供了一种有价值的方案。该方法适用于小鼠大脑体内应用的所有可转导细胞系。
所呈现的设置使用小鼠中人类起源的移植。由于免疫原性,这些移植在免疫功能正常的野生型小鼠中长期无效。因此,使用免疫缺陷NSG小鼠来克服这一限制。或者,使用小鼠移植可以优选地克服免疫原性方面。如果需要移植人类细胞,人源化小鼠模型代表了一种新兴的替代方案,以降低移植物排斥的可能性29。
使用EF1α启动子下由萤火虫荧光素酶和eGFP组成的商业双报告病毒载体来可视化移植。选择该启动子15以达到高信号强度。然而,除了NPC之外,其他细胞类型已被证明可以在受伤后促进脑功能,包括周细胞30和星形胶质细胞31;因此,根据所使用的细胞系,其他启动子可能更适合达到高表达水平。此外,使用转基因启动子,如CMV,可能导致下调,特别是在长期实验中32。慢病毒载体的转导效率很大程度上取决于所使用的细胞系,并且在单个实验之间可能有所不同。因此, 在开始体内 实验之前,必须评估转导效率,并纠正实验之间转导功效的变化。移植的大脑区域也会影响信号强度。虽然皮质移植的检测限达到<6,000个细胞,但可能需要更多的细胞来检测更深层大脑区域的信号,例如纹状体或海马体。
小鼠大脑中的移植体积限制为1-2μL。因此,确定适合实验的细胞号非常重要。先前已经观察到,增加细胞数量导致存活率降低,很可能是由于移植区域中营养物质和氧气的可用性有限33。与其他 体内 成像方法(如MRI或CT)相比, 体内 生物发光成像提供相对较低的空间分辨率。因此,嫁接细胞的短迁移路径只能在随后的 事后 分析中可靠地评估。
生物发光的绝对信号强度通常与移植的细胞数量成正比。然而,如果移植物移植到更深的大脑结构中,或者如果信号强度在 体内 成像系统的线性检测光谱之外,信号强度可能会降低。目前,开发新型底物以确保比D-荧光素更有效地穿透血脑屏障,包括cycluc1。这些底物可以在未来18进一步提高移植细胞的检测限。总体而言,该协议允许直接的微创手术来移植和观察小鼠大脑中的移植物。
The authors have nothing to disclose.
作者 RR 和 CT 感谢 Mäxi 基金会和 3R 能力中心的支持。
Viral Transduction | |||
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
Consumables | |||
Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
Microscope cover slips | Product of choice | ||
Microscope slides | Product of choice | ||
Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
Equipment | |||
Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
Heating pad | Product of choice | ||
High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
Microtome | Leica | HM430 | |
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
Pharmaceuticals and Reagents | |||
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
Donkey serum | Product of choice | ||
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ethanol; 70% | Product of choice | ||
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |