Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.
A terapia celular tem sido um paradigma de tratamento emergente na neurobiologia experimental. No entanto, os estudos de transplante celular muitas vezes dependem de medidas de ponto final e, portanto, só podem avaliar mudanças longitudinais de migração celular e sobrevivência em uma extensão limitada. Este artigo fornece um protocolo confiável e minimamente invasivo para transplantar e rastrear longitudinalmente células progenitoras neurais (NPCs) no cérebro de camundongos adultos. Antes do transplante, as células são transduzidas com um vetor lentiviral composto por um repórter bioluminescente (vagalumly-luciferase) e fluorescente (proteína fluorescente verde [GFP]). Os NPCs são transplantados no hemisfério cortical direito usando injeções estereoxilicas no córtex sensorial. Após o transplante, as células enxertadas foram detectadas através do crânio intacto por até cinco semanas (nos dias 0, 3, 14, 21, 35) com um limite de resolução de 6.000 células usando imagens de bioluminescência viva . Posteriormente, as células transplantadas são identificadas em seções cerebrais histológicas e ainda caracterizadas com imunofluorescência. Assim, este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para transplantar, rastrear, quantificar e caracterizar células no cérebro do camundongo.
O cérebro mamífero tem capacidades regenerativas limitadas após lesões ou doenças, exigindo estratégias inovadoras para promover o tecido e a reparação funcional. As estratégias pré-clínicas se concentram em diferentes aspectos da regeneração cerebral, incluindo neuroproteção, neurogênese, angiogênese 1,2, reparação da barreira hemencefálica 3,4 ou terapia celular 5,6. A terapia celular tem a vantagem de poder promover muitos desses processos pró-reparação simultaneamente. Em experimentos com transplante de células, a reparação tecidual ocorreu através de (1) substituição celular direta e (2) produção de citocinas que levam à angiogênese e neurogênese7. Os recentes avanços na tecnologia de células-tronco facilitaram ainda mais o desenvolvimento de fontes de células neurais escaláveis e bem caracterizadas que agora estão no pipeline para ensaios clínicos (revisados em 7,8,9). Embora as terapias celulares tenham atingido o estágio clínico de algumas doenças neurológicas (por exemplo, doença de Parkinson10, derrame11 e lesão medular12), sua eficácia tem sido variável, e mais pesquisas pré-clínicas são necessárias para entender os mecanismos das interações enxerto-hospedeiro.
Uma das principais limitações de muitos estudos pré-clínicos é o rastreamento contínuo das células transplantadas dentro do hospedeiro. Muitas vezes são realizadas apenas medições de ponto final, omitindo os processos dinâmicos migratórios e de sobrevivência no hospedeiro 6,13. Essas limitações resultam na má caracterização das células enxertadas e requerem altos números de animais para compreender mudanças longitudinais. Para superar essas limitações, neste estudo, transduzimos células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) com um vetor lentiviral de dois repórteres comercialmente disponível, composto por luciferase de vagalume vermelha e proteína fluorescente verde aprimorada (rFluc-eGFP). Essas células são transplantadas através de injeção intraparenquimal estereotaxa no cérebro do camundongo e são rastreadas longitudinalmente usando imagens de bioluminescência in vivo ao longo de 5 semanas. Após a coleta de tecido cerebral, as células enxertadas que expressam GFP são identificadas e ainda caracterizadas em seções cerebrais histológicas. Este método pode ser adaptado suavemente a fontes celulares transdutíveis alternativas e rotas de transplante para aplicações in vivo no cérebro de roedores. No geral, o procedimento é valioso para obter informações longitudinais de sobrevivência e migração do enxerto no cérebro do camundongo e facilita a caracterização histológica subsequente.
Regenerar o cérebro ferido para permitir a recuperação funcional continua sendo um desafio não cumprido. Muitas abordagens pré-clínicos inovadoras evoluíram visando, por exemplo, modulação imunológica 19,20, angiogênese 1,21,22,23, integridade da barreira hemencefálica 2,3,24,25 e substituição celular 5,26 . Especialmente nos últimos anos, as terapias baseadas em células surgiram como uma estratégia promissora de tratamento para o cérebro devido a grandes avanços na tecnologia de células-tronco e protocolos eficientes de diferenciação15,28. Este artigo fornece um protocolo valioso para transplantar e rastrear células neurais no cérebro do camundongo. O método é aplicável para todas as linhas celulares transduutíveis para aplicações in vivo no cérebro do camundongo.
A configuração apresentada utiliza transplantes de origem humana em um rato. Esses transplantes não são viáveis a longo prazo em camundongos do tipo selvagem imunocompetente devido à imunogenicidade. Assim, camundongos insg deficientes foram utilizados para superar essa limitação. Alternativamente, o uso de transplantes de camundongos pode ser preferido para superar os aspectos imunogênicos. Se o transplante de células humanas for necessário, os modelos de camundongos humanizados representam uma alternativa emergente para reduzir a probabilidade de rejeição do enxerto29.
Um vetor viral de dois repórteres comerciais composto por luciferase de vagalume e eGFP sob o EF1α promotor foi usado para visualizar os transplantes. Este promotor foi selecionado para alcançar uma alta intensidade de sinal15. No entanto, além dos NPCs, outros tipos de células têm sido mostrados para promover a função cerebral após a lesão, incluindo pericítos30 e astrócitos31; portanto, dependendo da linha celular utilizada, outros promotores podem ser mais adequados para alcançar altos níveis de expressão. Além disso, o uso de promotores transgênicos, como o CMV, pode levar à queda da regulação, especialmente em experimentos de longo prazo32. A eficiência de transdução do vetor lentiviral depende fortemente da linha celular usada e pode variar entre experimentos únicos. Portanto, a eficiência da transdução deve ser avaliada antes de iniciar os experimentos in vivo e corrigir variações na eficácia da transdução entre os experimentos. A região cerebral do transplante também influencia a força do sinal. Embora um limite de detecção de <6.000 células tenha sido alcançado para transplantes corticais, pode exigir mais células para detectar um sinal em regiões cerebrais mais profundas, por exemplo, estriado ou hipocampo.
Os volumes de transplante no cérebro do camundongo são limitados a 1-2 μL. Por isso, é importante identificar um número celular adequado para os experimentos. Observou-se anteriormente que o aumento do número de células leva à diminuição da taxa de sobrevivência, provavelmente devido à disponibilidade limitada de nutrientes e oxigênio na região do transplante33. A imagem de bioluminescência in vivo fornece uma resolução espacial relativamente baixa em comparação com outros métodos de imagem in vivo , como ressonância magnética ou tomografia computadorizada. Portanto, caminhos migratórios curtos de células enxertadas só podem ser avaliados de forma confiável na análise pós-hoc subsequente.
A força absoluta do sinal da bioluminescência é geralmente proporcional ao número celular transplantado. No entanto, a força do sinal pode ser reduzida se os enxertos forem transplantados em estruturas cerebrais mais profundas ou se a força do sinal estiver fora do espectro de detecção linear do sistema de imagem in vivo . Atualmente, novos substratos são desenvolvidos para garantir uma penetração mais eficiente em toda a barreira hemencefálica do que a D-luciferina, incluindo o cicluc1. Esses substratos podem melhorar ainda mais o limite de detecção das células enxertadas no futuro18. No geral, este protocolo permite um procedimento simples e minimamente invasivo para transplantar e observar enxertos no cérebro do camundongo.
The authors have nothing to disclose.
Os autores RR e CT reconhecem o apoio da Fundação Mäxi e do Centro de Competência 3R.
Viral Transduction | |||
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
Consumables | |||
Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
Microscope cover slips | Product of choice | ||
Microscope slides | Product of choice | ||
Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
Equipment | |||
Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
Heating pad | Product of choice | ||
High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
Microtome | Leica | HM430 | |
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
Pharmaceuticals and Reagents | |||
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
Donkey serum | Product of choice | ||
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ethanol; 70% | Product of choice | ||
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |