Nous décrivons la transplantation intraparenchymateuse de cellules progénitrices neurales humaines transduites avec un double vecteur rapporteur exprimant la protéine fluorescente vert luciférase (GFP) dans le cerveau de la souris. Après la transplantation, le signal de la luciférase est mesuré à plusieurs reprises à l’aide de la bioluminescence in vivo et de cellules greffées exprimant la GFP identifiées dans des sections du cerveau à l’aide de la microscopie à fluorescence.
La thérapie cellulaire est depuis longtemps un paradigme de traitement émergent en neurobiologie expérimentale. Cependant, les études de transplantation cellulaire reposent souvent sur des mesures finales et ne peuvent donc évaluer que les changements longitudinaux de la migration et de la survie cellulaires dans une mesure limitée. Cet article fournit un protocole fiable et peu invasif pour transplanter et suivre longitudinalement les cellules progénitrices neurales (NPC) dans le cerveau de la souris adulte. Avant la transplantation, les cellules sont transduites avec un vecteur lentiviral comprenant un rapporteur bioluminescent (luciole-luciférase) et fluorescent (protéine fluorescente verte [GFP]). Les PNJ sont transplantés dans l’hémisphère cortical droit à l’aide d’injections stéréotaxiques dans le cortex sensorimoteur. Après la transplantation, des cellules greffées ont été détectées à travers le crâne intact pendant cinq semaines (aux jours 0, 3, 14, 21, 35) avec une limite de résolution de 6 000 cellules en utilisant l’imagerie par bioluminescence in vivo . Par la suite, les cellules transplantées sont identifiées dans des sections histologiques du cerveau et caractérisées par immunofluorescence. Ainsi, ce protocole fournit un outil précieux pour transplanter, suivre, quantifier et caractériser les cellules du cerveau de la souris.
Le cerveau des mammifères a des capacités de régénération limitées à la suite d’une blessure ou d’une maladie, ce qui nécessite des stratégies innovantes pour favoriser la réparation tissulaire et fonctionnelle. Les stratégies précliniques se concentrent sur différents aspects de la régénération du cerveau, y compris la neuroprotection, la neurogenèse, l’angiogenèse 1,2, la réparation de la barrière hémato-encéphalique 3,4 ou la thérapie cellulaire 5,6. La thérapie cellulaire a l’avantage de pouvoir promouvoir simultanément bon nombre de ces processus pro-réparation. Dans les expériences de transplantation de cellules, la réparation tissulaire s’est produite par (1) le remplacement cellulaire direct et (2) la production de cytokines conduisant à l’angiogenèse et à la neurogenèse7. Les progrès récents de la technologie des cellules souches ont facilité davantage le développement de sources de cellules neurales évolutives et bien caractérisées qui sont maintenant en cours d’essais cliniques (examinés dans 7,8,9). Bien que les thérapies cellulaires aient atteint le stade clinique pour quelques maladies neurologiques (p. ex., la maladie de Parkinson10, l’AVC11 et les lésions de la moelle épinière12), leur efficacité a été variable et des recherches précliniques supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les mécanismes des interactions greffe-hôte.
Une limitation majeure de nombreuses études précliniques est le suivi continu des cellules transplantées à l’intérieur de l’hôte. Souvent, seules des mesures de point final sont effectuées, en omettant les processus dynamiques de migration et de survie chez l’hôte 6,13. Ces limitations entraînent une mauvaise caractérisation des cellules greffées et nécessitent un nombre élevé d’animaux pour comprendre les changements longitudinaux. Pour surmonter ces limites, dans cette étude, nous transduisons des cellules progénitrices neurales induites dérivées de cellules souches pluripotentes (iPSC) avec un vecteur lentiviral double rapporteur disponible dans le commerce composé de luciole rouge luciférase et de protéine fluorescente verte améliorée (rFluc-eGFP). Ces cellules sont transplantées par injection intraparenchymateuse stéréotaxique dans le cerveau de la souris et font l’objet d’un suivi longitudinal à l’aide de l’imagerie par bioluminescence in vivo sur une période de 5 semaines. Après la collecte de tissus cérébraux, les cellules greffées exprimant la GFP sont identifiées et caractérisées dans des sections histologiques du cerveau. Cette méthode peut être adaptée en douceur à d’autres sources cellulaires transductibles et voies de transplantation pour des applications in vivo dans le cerveau des rongeurs. Dans l’ensemble, la procédure est précieuse pour obtenir des informations longitudinales sur la survie et la migration du greffon dans le cerveau de la souris et facilite la caractérisation histologique ultérieure.
La régénération du cerveau blessé pour permettre la récupération fonctionnelle reste un défi non relevé. De nombreuses approches précliniques innovantes ont évolué en ciblant, par exemple, la modulation immunitaire19,20, l’angiogenèse 1,21,22,23, l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique 2,3,24,25 et le remplacement cellulaire 5,26 . Surtout ces dernières années, les thérapies cellulaires sont apparues comme une stratégie de traitement prometteuse pour le cerveau en raison des progrès majeurs de la technologie des cellules souches et des protocoles de différenciation efficaces15,28. Cet article fournit un protocole précieux pour la transplantation et le suivi des cellules neurales dans le cerveau de la souris. La méthode est applicable à toutes les lignées cellulaires transductibles pour des applications in vivo dans le cerveau de la souris.
La configuration présentée utilise des greffes d’origine humaine chez une souris. Ces greffes ne sont pas viables à long terme chez les souris de type sauvage immunocompétentes en raison de l’immunogénicité. Par conséquent, des souris NSG immunodéficientes ont été utilisées pour surmonter cette limitation. Alternativement, l’utilisation de greffes de souris peut être préférée pour surmonter les aspects immunogènes. Si la transplantation de cellules humaines est nécessaire, les modèles murins humanisés représentent une alternative émergente pour réduire la probabilité de rejet du greffon29.
Un vecteur viral commercial à double rapporteur composé de luciole luciférase et d’eGFP sous le promoteur EF1α a été utilisé pour visualiser les greffes. Ce promoteur a été sélectionné pour atteindre une intensité de signal élevéede 15. Cependant, en dehors des PNJ, il a été démontré que d’autres types de cellules favorisent la fonction cérébrale après une blessure, notamment les péricytes30 et les astrocytes31; par conséquent, selon la lignée cellulaire utilisée, d’autres promoteurs pourraient être plus appropriés pour atteindre des niveaux d’expression élevés. En outre, l’utilisation de promoteurs de transgènes, tels que le CMV, peut entraîner une régulation négative, en particulier dans les expériences à long terme32. L’efficacité de transduction du vecteur lentiviral dépend fortement de la lignée cellulaire utilisée et peut varier d’une expérience à l’autre. Par conséquent, l’efficacité de la transduction doit être évaluée avant de commencer les expériences in vivo et pour corriger les variations de l’efficacité de la transduction entre les expériences. La région cérébrale de la transplantation influence également la force du signal. Bien qu’une limite de détection de < 6 000 cellules ait été atteinte pour les transplantations corticales, il peut falloir plus de cellules pour détecter un signal dans des régions cérébrales plus profondes, par exemple le striatum ou l’hippocampe.
Les volumes de transplantation dans le cerveau de la souris sont limités à 1-2 μL. Par conséquent, il est important d’identifier un numéro de cellule approprié pour les expériences. Il a déjà été observé que l’augmentation du nombre de cellules entraîne une diminution du taux de survie, probablement en raison de la disponibilité limitée des nutriments et de l’oxygène dans la région de la transplantation33. L’imagerie par bioluminescence in vivo offre une résolution spatiale relativement faible par rapport à d’autres méthodes d’imagerie in vivo telles que l’IRM ou la tomodensitométrie. Par conséquent, les chemins migratoires courts des cellules greffées ne peuvent être évalués de manière fiable que dans l’analyse post-hoc ultérieure.
La force absolue du signal de la bioluminescence est généralement proportionnelle au nombre de cellules transplantées. Cependant, la force du signal peut être réduite si les greffons sont transplantés dans des structures cérébrales plus profondes ou si la force du signal est en dehors du spectre de détection linéaire du système d’imagerie in vivo . Actuellement, de nouveaux substrats sont développés pour assurer une pénétration plus efficace à travers la barrière hémato-encéphalique que la D-luciférine, y compris le cycluc1. Ces substrats pourraient encore améliorer la limite de détection des cellules greffées à l’avenir18. Dans l’ensemble, ce protocole permet une procédure simple et peu invasive pour transplanter et observer les greffons dans le cerveau de la souris.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs RR et CT reconnaissent le soutien de la Fondation Mäxi et du Centre de compétences 3R.
Viral Transduction | |||
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
Consumables | |||
Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
Microscope cover slips | Product of choice | ||
Microscope slides | Product of choice | ||
Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
Equipment | |||
Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
Heating pad | Product of choice | ||
High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
Microtome | Leica | HM430 | |
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
Pharmaceuticals and Reagents | |||
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
Donkey serum | Product of choice | ||
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ethanol; 70% | Product of choice | ||
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |