Describimos el trasplante intraparenquimatoso de células progenitoras neurales humanas transducidas con un vector informador dual que expresa la proteína fluorescente verde luciferasa (GFP) en el cerebro del ratón. Después del trasplante, la señal de luciferasa se mide repetidamente utilizando bioluminiscencia in vivo y células injertadas que expresan GFP identificadas en secciones cerebrales mediante microscopía de fluorescencia.
La terapia celular ha sido durante mucho tiempo un paradigma de tratamiento emergente en neurobiología experimental. Sin embargo, los estudios de trasplante celular a menudo se basan en mediciones de punto final y, por lo tanto, solo pueden evaluar los cambios longitudinales de la migración celular y la supervivencia en una medida limitada. Este documento proporciona un protocolo confiable y mínimamente invasivo para trasplantar y rastrear longitudinalmente las células progenitoras neurales (NPC) en el cerebro de ratón adulto. Antes del trasplante, las células se transducen con un vector lentiviral que comprende un reportero bioluminiscente (luciérnaga-luciferasa) y fluorescente (proteína fluorescente verde [GFP]). Los NPC se trasplantan al hemisferio cortical derecho mediante inyecciones estereotáxicas en la corteza sensoriomotora. Después del trasplante, se detectaron células injertadas a través del cráneo intacto durante un máximo de cinco semanas (en los días 0, 3, 14, 21, 35) con un límite de resolución de 6.000 células utilizando imágenes de bioluminiscencia in vivo . Posteriormente, las células trasplantadas se identifican en secciones histológicas del cerebro y se caracterizan con inmunofluorescencia. Por lo tanto, este protocolo proporciona una herramienta valiosa para trasplantar, rastrear, cuantificar y caracterizar células en el cerebro del ratón.
El cerebro de los mamíferos tiene capacidades regenerativas limitadas después de una lesión o enfermedad, lo que requiere estrategias innovadoras para promover la reparación funcional y de tejidos. Las estrategias preclínicas se centran en diferentes aspectos de la regeneración cerebral, incluyendo la neuroprotección, la neurogénesis, la angiogénesis 1,2, la reparación de la barrera hematoencefálica 3,4 o la terapia celular 5,6. La terapia celular tiene la ventaja de poder promover muchos de estos procesos pro-reparación simultáneamente. En experimentos con trasplante de células, la reparación de tejidos se ha producido a través de (1) el reemplazo celular directo y (2) la producción de citoquinas que conducen a la angiogénesis y la neurogénesis7. Los recientes avances en la tecnología de células madre han facilitado aún más el desarrollo de fuentes de células neuronales escalables y bien caracterizadas que ahora están en preparación para ensayos clínicos (revisados en 7,8,9). Aunque las terapias celulares han alcanzado la etapa clínica para algunas enfermedades neurológicas (por ejemplo, enfermedad de Parkinson10, accidente cerebrovascular11 y lesión de la médula espinal12), su eficacia ha sido variable, y se necesita más investigación preclínica para comprender los mecanismos de las interacciones injerto-huésped.
Una limitación importante de muchos estudios preclínicos es el seguimiento continuo de las células trasplantadas dentro del huésped. A menudo solo se realizan mediciones de punto final, omitiendo los procesos migratorios y de supervivencia dinámicos en el huésped 6,13. Estas limitaciones resultan en la caracterización deficiente de las células injertadas y requieren un alto número de animales para comprender los cambios longitudinales. Para superar estas limitaciones, en este estudio, transducimos células progenitoras neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) con un vector lentiviral de doble reportero disponible comercialmente que consiste en luciferasa de luciérnaga roja y proteína fluorescente verde mejorada (rFluc-eGFP). Estas células se trasplantan a través de una inyección estereotáxica intraparenquimatosa en el cerebro del ratón y se rastrean longitudinalmente utilizando imágenes de bioluminiscencia in vivo durante 5 semanas. Después de la recolección de tejido cerebral, las células injertadas que expresan GFP se identifican y se caracterizan aún más en las secciones histológicas del cerebro. Este método se puede adaptar sin problemas a fuentes celulares transducibles alternativas y rutas de trasplante para aplicaciones in vivo en el cerebro de roedores. En general, el procedimiento es valioso para obtener información longitudinal de la supervivencia y migración del injerto en el cerebro del ratón y facilita la posterior caracterización histológica.
Regenerar el cerebro lesionado para permitir la recuperación funcional sigue siendo un desafío insatisfecho. Muchos enfoques preclínicos innovadores han evolucionado dirigiéndose, por ejemplo, la modulación inmune 19,20, la angiogénesis 1,21,22,23, la integridad de la barrera hematoencefálica 2,3,24,25 y el reemplazo celular 5,26 . Especialmente en los últimos años, las terapias basadas en células han surgido como una estrategia de tratamiento prometedora para el cerebro debido a los importantes avances en la tecnología de células madre y los protocolos de diferenciación eficientes15,28. Este documento proporciona un protocolo valioso para el trasplante y seguimiento de células neuronales en el cerebro de ratón. El método es aplicable a todas las líneas celulares transducibles para aplicaciones in vivo en el cerebro del ratón.
La configuración presentada utiliza trasplantes de origen humano en un ratón. Estos trasplantes no son viables a largo plazo en ratones inmunocompetentes de tipo salvaje debido a la inmunogenicidad. Por lo tanto, se utilizaron ratones NSG inmunodeficientes para superar esta limitación. Alternativamente, se puede preferir el uso de trasplantes de ratón para superar los aspectos inmunogénicos. Si se requiere el trasplante de células humanas, los modelos de ratón humanizados representan una alternativa emergente para reducir la probabilidad de rechazo del injerto29.
Se utilizó un vector viral comercial de doble reportero que consiste en luciferasa luciérnaga y eGFP bajo el promotor EF1α para visualizar los trasplantes. Este promotor fue seleccionado para lograr una alta intensidad de señal15. Sin embargo, aparte de los NPC, se ha demostrado que otros tipos de células promueven la función cerebral después de una lesión, incluidos los pericitos30 y los astrocitos31; por lo tanto, dependiendo de la línea celular utilizada, otros promotores podrían ser más adecuados para lograr altos niveles de expresión. Además, el uso de promotores de transgenes, como el CMV, puede conducir a una regulación a la baja, especialmente en experimentos a largo plazo32. La eficiencia de transducción del vector lentiviral depende en gran medida de la línea celular utilizada y puede variar entre experimentos individuales. Por lo tanto, la eficiencia de la transducción debe evaluarse antes de comenzar los experimentos in vivo y para corregir las variaciones en la eficacia de la transducción entre experimentos. La región cerebral del trasplante también influye en la intensidad de la señal. Aunque se alcanzó un límite de detección de <6.000 células para los trasplantes corticales, puede requerir más células para detectar una señal en regiones cerebrales más profundas, por ejemplo, el cuerpo estriado o el hipocampo.
Los volúmenes de trasplante en el cerebro del ratón están limitados a 1-2 μL. Por lo tanto, es importante identificar un número de célula adecuado para los experimentos. Se ha observado previamente que el aumento del número de células conduce a una disminución de la tasa de supervivencia, muy probablemente debido a la disponibilidad limitada de nutrientes y oxígeno en la región del trasplante33. Las imágenes de bioluminiscencia in vivo proporcionan una resolución espacial relativamente baja en comparación con otros métodos de imágenes in vivo , como la resonancia magnética o la tomografía computarizada. Por lo tanto, las rutas migratorias cortas de las células injertadas solo pueden evaluarse de manera confiable en el análisis post-hoc posterior.
La intensidad absoluta de la señal de la bioluminiscencia es generalmente proporcional al número de células trasplantadas. Sin embargo, la intensidad de la señal podría reducirse si los injertos se trasplantan en estructuras cerebrales más profundas o si la intensidad de la señal está fuera del espectro de detección lineal del sistema de imágenes in vivo . Actualmente, se desarrollan nuevos sustratos para garantizar una penetración más eficiente a través de la barrera hematoencefálica que la D-luciferina, incluido el ciclcuc1. Estos sustratos pueden mejorar aún más el límite de detección de las células injertadas en el futuro18. En general, este protocolo permite un procedimiento sencillo y mínimamente invasivo para trasplantar y observar injertos en el cerebro del ratón.
The authors have nothing to disclose.
Los autores RR y CT reconocen el apoyo de la Fundación Mäxi y el Centro de Competencia 3R.
Viral Transduction | |||
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
Consumables | |||
Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
Microscope cover slips | Product of choice | ||
Microscope slides | Product of choice | ||
Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
Equipment | |||
Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
Heating pad | Product of choice | ||
High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
Microtome | Leica | HM430 | |
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
Pharmaceuticals and Reagents | |||
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
Donkey serum | Product of choice | ||
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ethanol; 70% | Product of choice | ||
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |