Мы описываем внутрипаренхимальную трансплантацию нейронных клеток-предшественников человека, трансдуцированных двойным репортерным вектором, экспрессирующим люциферазно-зеленый флуоресцентный белок (GFP) в мозге мыши. После трансплантации сигнал люциферазы многократно измеряется с использованием биолюминесценции in vivo и GFP-экспрессирующих трансплантированных клеток, идентифицированных в участках мозга с помощью флуоресцентной микроскопии.
Клеточная терапия уже давно является новой парадигмой лечения в экспериментальной нейробиологии. Тем не менее, исследования клеточной трансплантации часто полагаются на измерения конечных точек и, следовательно, могут оценивать только продольные изменения миграции клеток и выживаемости в ограниченной степени. В этой статье представлен надежный, минимально инвазивный протокол для трансплантации и продольного отслеживания нейронных клеток-предшественников (NPC) в мозге взрослой мыши. Перед трансплантацией клетки трансдуцируют лентивирусным вектором, включающим биолюминесцентный (светлячок-люцифераза) и флуоресцентный (зеленый флуоресцентный белок [GFP]) репортер. NPC пересаживаются в правое корковое полушарие с помощью стереотаксических инъекций в сенсомоторную кору. После трансплантации трансплантированные клетки были обнаружены через неповрежденный череп в течение пяти недель (в дни 0, 3, 14, 21, 35) с пределом разрешения 6000 клеток с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo . Впоследствии трансплантированные клетки идентифицируются в гистологических срезах мозга и далее характеризуются иммунофлуоресценцией. Таким образом, этот протокол предоставляет ценный инструмент для трансплантации, отслеживания, количественной оценки и характеристики клеток в мозге мыши.
Мозг млекопитающих имеет ограниченные регенеративные способности после травмы или заболевания, что требует инновационных стратегий для содействия тканевому и функциональному восстановлению. Доклинические стратегии сосредоточены на различных аспектах регенерации мозга, включая нейропротекцию, нейрогенез, ангиогенез 1,2, восстановление гематоэнцефалического барьера 3,4 или клеточнуютерапию 5,6. Преимущество клеточной терапии заключается в том, что она способна одновременно способствовать многим из этих процессов восстановления. В экспериментах с трансплантацией клеток восстановление тканей происходило посредством (1) прямой замены клеток и (2) производства цитокинов, приводящих к ангиогенезу и нейрогенезу7. Последние достижения в технологии стволовых клеток еще больше способствовали разработке масштабируемых, хорошо охарактеризованных источников нервных клеток, которые в настоящее время находятся в стадии клинических испытаний (рассмотрено в 7,8,9). Хотя клеточная терапия достигла клинической стадии для нескольких неврологических заболеваний (например, болезнь Паркинсона10, инсульт11 и повреждение спинного мозга12), их эффективность была переменной, и для понимания механизмов взаимодействия трансплантата и хозяина необходимы дополнительные доклинические исследования.
Одним из основных ограничений многих доклинических исследований является непрерывное отслеживание трансплантированных клеток внутри хозяина. Часто проводятся только измерения конечных точек, исключая динамические миграционные процессы и процессы выживания у хозяина 6,13. Эти ограничения приводят к плохой характеристике привитых клеток и требуют большого количества животных для понимания продольных изменений. Чтобы преодолеть эти ограничения, в этом исследовании мы трансдуцируем индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из нейронных клеток-предшественников, с коммерчески доступным лентивирусным вектором с двойным репортером, состоящим из люциферазы красного светлячка и усиленного зеленого флуоресцентного белка (rFluc-eGFP). Эти клетки трансплантируются с помощью стереотаксической интрапаренхимальной инъекции в мозг мыши и продольно отслеживаются с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo в течение 5 недель. После забора мозговой ткани GFP-экспрессирующие трансплантированные клетки идентифицируются и далее характеризуются в гистологических срезах мозга. Этот метод может быть плавно адаптирован к альтернативным трансдуцируемым клеточным источникам и путям трансплантации для применения in vivo в мозге грызунов. В целом, процедура ценна для получения продольной информации о выживании и миграции трансплантата в мозге мыши и облегчает последующую гистологическую характеристику.
Регенерация поврежденного мозга для функционального восстановления остается нерешенной задачей. Многие инновационные доклинические подходы развили таргетирование, например, иммунная модуляция19,20, ангиогенез 1,21,22,23, целостность гематоэнцефалического барьера 2,3,24,25 и замена клеток 5,26 . Особенно в последние годы клеточная терапия стала многообещающей стратегией лечения мозга благодаря значительным достижениям в технологии стволовых клеток и эффективным протоколам дифференцировки15,28. Эта статья предоставляет ценный протокол для трансплантации и отслеживания нервных клеток в мозге мыши. Метод применим для всех трансдуцируемых клеточных линий для применения in vivo в мозге мыши.
Представленная установка использует трансплантаты человеческого происхождения у мыши. Эти трансплантации нежизнеспособны в долгосрочной перспективе у иммунокомпетентных мышей дикого типа из-за иммуногенности. Следовательно, иммунодефицитные мыши NSG использовались для преодоления этого ограничения. Альтернативно, использование мышиных трансплантатов может быть предпочтительным для преодоления иммуногенных аспектов. Если требуется трансплантация клеток человека, гуманизированные мышиные модели представляют собой новую альтернативу для снижения вероятности отторжения трансплантата29.
Для визуализации трансплантатов использовался коммерческий вирусный вектор с двойным репортером, состоящий из люциферазы светлячка и eGFP под промотором EF1α. Этот промотор был выбран для достижения высокой интенсивности сигнала15. Однако, помимо NPC, было показано, что другие типы клеток способствуют функции мозга после травмы, включая перициты30 и астроциты31; следовательно, в зависимости от используемой клеточной линии, другие промоторы могут быть более подходящими для достижения высоких уровней экспрессии. Кроме того, использование трансгенных промоторов, таких как ЦМВ, может привести к понижению регуляции, особенно в долгосрочных экспериментах32. Эффективность трансдукции лентивирусного вектора сильно зависит от используемой клеточной линии и может варьироваться между одиночными экспериментами. Поэтому эффективность трансдукции должна быть оценена до начала экспериментов in vivo и для коррекции вариаций эффективности трансдукции между экспериментами. Область мозга при трансплантации также влияет на силу сигнала. Хотя предел обнаружения <6000 клеток был достигнут для трансплантации коры, может потребоваться больше клеток для обнаружения сигнала в более глубоких областях мозга, например, полосатом теле или гиппокампе.
Объемы трансплантации в мозге мыши ограничены 1-2 мкл. Поэтому важно определить подходящий номер ячейки для экспериментов. Ранее было замечено, что увеличение количества клеток приводит к снижению выживаемости, скорее всего, из-за ограниченной доступности питательных веществ и кислорода в области трансплантации33. Биолюминесцентная визуализация in vivo обеспечивает относительно низкое пространственное разрешение по сравнению с другими методами визуализации in vivo , такими как МРТ или КТ. Поэтому короткие миграционные пути привитых клеток могут быть достоверно оценены только при последующем пост-хок анализе .
Абсолютная сила сигнала биолюминесценции, как правило, пропорциональна количеству трансплантированных клеток. Однако сила сигнала может быть уменьшена, если трансплантаты пересаживаются в более глубокие структуры мозга или если сила сигнала находится за пределами линейного спектра обнаружения системы визуализации in vivo . В настоящее время разрабатываются новые субстраты для обеспечения более эффективного проникновения через гематоэнцефалический барьер, чем D-люциферин, включая цикл1. Эти субстраты могут дополнительно улучшить предел обнаружения привитых клеток в будущем18. В целом, этот протокол позволяет проводить простую, минимально инвазивную процедуру трансплантации и наблюдения за трансплантатами в мозге мыши.
The authors have nothing to disclose.
Авторы RR и CT признают поддержку со стороны Фонда Mäxi и Центра компетенции 3R.
Viral Transduction | |||
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
Consumables | |||
Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
Microscope cover slips | Product of choice | ||
Microscope slides | Product of choice | ||
Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
Equipment | |||
Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
Heating pad | Product of choice | ||
High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
Microtome | Leica | HM430 | |
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
Pharmaceuticals and Reagents | |||
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
Donkey serum | Product of choice | ||
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ethanol; 70% | Product of choice | ||
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |