我々は、マウス脳におけるルシフェラーゼ緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する二重レポーターベクターで形質導入されたヒト神経前駆細胞の実質内移植について説明する。移植後、ルシフェラーゼシグナルは、蛍光顕微鏡を用いて脳切片で同定された in vivo 生物発光およびGFP発現移植細胞を用いて繰り返し測定される。
細胞療法は、長い間、実験的神経生物学における新たな治療パラダイムであった。しかし、細胞移植研究はしばしばエンドポイント測定に依存しているため、限られた範囲でしか細胞遊走および生存の縦方向の変化を評価することができない。この論文は、成体マウスの脳に神経前駆細胞(NPC)を移植し、縦方向に追跡するための信頼性が高く、低侵襲のプロトコルを提供する。移植前に、細胞は、生物発光(ホタル – ルシフェラーゼ)および蛍光(緑色蛍光タンパク質[GFP])レポーターを含むレンチウイルスベクターで形質導入される。NPCは、感覚運動皮質における定位注射を用いて右皮質半球に移植される。移植後、移植された細胞は、 in vivo 生物発光イメージングを使用して、6,000細胞の分解能限界で最大5週間(0、3、14、21、35日目)無傷の頭蓋骨を通して検出されました。続いて、移植された細胞は、組織学的脳切片において同定され、さらに免疫蛍光で特徴付けられる。したがって、このプロトコルは、マウス脳内の細胞を移植、追跡、定量化、および特徴付けるための貴重なツールを提供します。
哺乳類の脳は、傷害や病気後の再生能力が限られており、組織や機能修復を促進するための革新的な戦略が必要です。前臨床戦略は、神経保護、神経新生、血管新生1,2、血液脳関門修復3,4、または細胞療法5,6を含む脳再生のさまざまな側面に焦点を当てる。細胞療法は、これらの修復促進プロセスの多くを同時に促進することができるという利点を有する。細胞の移植実験では、(1)細胞の直接置換と(2)血管新生と神経新生につながるサイトカインの産生によって組織修復が起こっています7。幹細胞技術の最近の進歩は、現在臨床試験のパイプラインにあるスケーラブルで十分に特徴付けられた神経細胞源の開発をさらに促進しました(7,8,9でレビュー)。細胞療法は、いくつかの神経学的疾患(例えば、パーキンソン病10、脳卒中11、および脊髄損傷12)の臨床段階に達しているが、それらの有効性は可変であり、移植片と宿主の相互作用のメカニズムを理解するためには、より多くの前臨床研究が必要である。
多くの前臨床試験の1つの主要な制限は、宿主内部の移植細胞の継続的な追跡である。エンドポイント測定のみが実行されることが多く、ホスト6、13における動的移動および生存プロセスを省略する。これらの制限は、移植された細胞の不十分な特性評価をもたらし、縦方向の変化を理解するために高い動物数を必要とする。これらの限界を克服するために、本研究では、誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の神経前駆細胞を、赤色ホタルルシフェラーゼおよび増強緑色蛍光タンパク質(rFluc-eGFP)からなる市販のデュアルレポーターレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。これらの細胞は、定位イントラップ実質注射を介してマウス脳に移植され、5週間にわたって in vivo 生物発光イメージングを用いて縦方向に追跡される。脳組織採取後、GFP発現移植細胞が同定され、組織学的脳切片においてさらに特徴付けられる。この方法は、げっ歯類の脳 におけるin vivo 適用のための代替形質導入可能な細胞源および移植経路に円滑に適合させることができる。全体として、この手順は、マウス脳における移植片の生存および遊走の縦断的情報を得るために貴重であり、その後の組織学的特徴付けを容易にする。
機能回復を可能にするために負傷した脳を再生することは、未解決の課題のままです。多くの革新的な前臨床アプローチは、例えば、免疫調節19、20、血管新生1、21、22、23、血液脳関門完全性2、3、24、25、および細胞置換5,26を標的とする進化してきた。.特に近年、細胞ベースの治療法は、幹細胞技術の大きな進歩と効率的な分化プロトコル15,28により、脳の有望な治療戦略として浮上しています。この論文は、マウス脳に神経細胞を移植および追跡するための貴重なプロトコルを提供する。この方法は、マウス脳におけるインビボ適用のためのすべての形質導入可能な細胞株に適用可能である。
提示されたセットアップは、マウスにヒト起源の移植を使用する。これらの移植は、免疫原性のために免疫能を有する野生型マウスにおいて長期的には生存できない。したがって、免疫不全NSGマウスは、この制限を克服するために使用された。あるいは、マウス移植の使用は、免疫原性の側面を克服するために好ましい場合がある。ヒト細胞の移植が必要な場合、ヒト化マウスモデルは、移植片拒絶反応の可能性を低下させるための新たな代替手段である29。
EF1αプロモータ下のホタルルシフェラーゼとeGFPからなる市販のデュアルレポーターウイルスベクターを用いて、移植を可視化した。このプロモータは、高い信号強度15を達成するために選択された。しかし、NPCとは別に、周皮細胞30およびアストロサイト31を含む他の細胞型が傷害後の脳機能を促進することが示されている。したがって、使用される細胞株に応じて、他のプロモーターが高発現レベルを達成するためにより適している可能性がある。さらに、CMVなどの導入遺伝子プロモーターの使用は、特に長期実験において、ダウンレギュレーションをもたらし得る32。レンチウイルスベクターの形質導入効率は、使用される細胞株に強く依存し、単一の実験間で変化し得る。したがって、形質導入効率は 、in vivo 実験を開始する前に評価し、実験間の形質導入有効性の変動を補正する必要があります。移植の脳領域も信号強度に影響します。皮質移植では<6,000個の細胞の検出限界が達成されたが、線条体や海馬などのより深い脳領域でシグナルを検出するためにより多くの細胞が必要になる可能性がある。
マウス脳内の移植量は1〜2μLに制限されている。したがって、実験に適した細胞数を特定することが重要である。細胞数の増加が生存率の低下につながることは以前に観察されており、移植領域における栄養素および酸素の利用可能性が限られているためである可能性が最も高い33。インビボ生物発光イメージングは、MRIまたはCTなどの他のインビボイメージング方法と比較して比較的低い空間分解能を提供する。したがって、移植された細胞の短い遊走経路は、その後の事後分析においてのみ確実に評価することができる。
生物発光の絶対信号強度は、一般に、移植細胞数に比例する。しかし、移植片がより深い脳構造に移植された場合、または信号強度が in vivo イメージングシステムの線形検出スペクトルの外側にある場合、信号強度が低下する可能性があります。現在、cycluc1を含むD-ルシフェリンよりも血液脳関門を横切るより効率的な浸透を確実にするために、新しい基質が開発されている。これらの基質は、移植された細胞の検出限界を将来さらに改善する可能性がある18。全体として、このプロトコルは、マウス脳に移植片を移植および観察するための簡単で低侵襲の手順を可能にする。
The authors have nothing to disclose.
著者RRとCTは、Mäxi財団と3Rコンピテンスセンターからの支援を認めています。
Viral Transduction | |||
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
Consumables | |||
Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
Microscope cover slips | Product of choice | ||
Microscope slides | Product of choice | ||
Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
Equipment | |||
Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
Heating pad | Product of choice | ||
High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
Microtome | Leica | HM430 | |
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
Pharmaceuticals and Reagents | |||
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
Donkey serum | Product of choice | ||
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ethanol; 70% | Product of choice | ||
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |