Fare beyninde lusiferaz-yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden ikili muhabir bir vektör ile transdüke edilen insan nöral progenitör hücrelerinin intraparankimal transplantasyonunu tanımladık. Transplantasyondan sonra, lusiferaz sinyali, floresan mikroskobu kullanılarak beyin bölümlerinde tanımlanan in vivo biyolüminesans ve GFP eksprese eden aşılanmış hücreler kullanılarak tekrar tekrar ölçülür.
Hücre tedavisi uzun zamandır deneysel nörobiyolojide ortaya çıkan bir tedavi paradigması olmuştur. Bununla birlikte, hücre nakli çalışmaları genellikle son nokta ölçümlerine dayanır ve bu nedenle hücre göçü ve sağkalımının uzunlamasına değişikliklerini yalnızca sınırlı bir ölçüde değerlendirebilir. Bu makale, yetişkin fare beynindeki nöral progenitör hücrelerin (NPC’ler) nakli ve uzunlamasına izlenmesi için güvenilir, minimal invaziv bir protokol sunmaktadır. Transplantasyondan önce, hücreler bir biyolüminesan (ateşböceği-lusiferaz) ve floresan (yeşil floresan protein [GFP]) muhabirinden oluşan bir lentiviral vektör ile dönüştürülür. NPC’ler, sensorimotor kortekste stereotaksik enjeksiyonlar kullanılarak sağ kortikal yarımküreye nakledilir. Transplantasyonu takiben, aşılanmış hücreler bozulmamış kafatası yoluyla beş haftaya kadar (0, 3, 14, 21, 35. günlerde) in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanılarak 6.000 hücrelik bir çözünürlük sınırı ile tespit edildi. Daha sonra, nakledilen hücreler histolojik beyin kesitlerinde tanımlanır ve ayrıca immünofloresan ile karakterize edilir. Bu nedenle, bu protokol fare beynindeki hücreleri nakletmek, izlemek, ölçmek ve karakterize etmek için değerli bir araç sağlar.
Memeli beyni, yaralanma veya hastalıktan sonra sınırlı rejeneratif kapasiteye sahiptir ve doku ve fonksiyonel onarımı teşvik etmek için yenilikçi stratejiler gerektirir. Preklinik stratejiler, nöroproteksiyon, nörogenez, anjiyogenez1,2, kan-beyin-bariyer onarımı3,4 veya hücre tedavisi 5,6 dahil olmak üzere beyin rejenerasyonunun farklı yönlerine odaklanır. Hücre tedavisi, bu onarım öncesi süreçlerin çoğunu aynı anda teşvik edebilme avantajına sahiptir. Hücre nakli ile yapılan deneylerde, doku onarımı (1) doğrudan hücre replasmanı ve (2) anjiyogenez ve nörogeneze yol açan sitokinlerin üretimi yoluyla gerçekleşmiştir7. Kök hücre teknolojisindeki son gelişmeler, şu anda klinik çalışmalar için boru hattında olan ölçeklenebilir, iyi karakterize edilmiş sinir hücresi kaynaklarının geliştirilmesini daha da kolaylaştırmıştır (7,8,9’da gözden geçirilmiştir). Hücre tedavileri birkaç nörolojik hastalık için klinik aşamaya ulaşmış olsa da (örneğin, Parkinson hastalığı10, inme11 ve omurilik yaralanması12), etkinlikleri değişkendir ve greft-konakçı etkileşimlerinin mekanizmalarını anlamak için daha fazla klinik öncesi araştırmaya ihtiyaç vardır.
Birçok preklinik çalışmanın önemli bir sınırlaması, konakçı içindeki nakledilen hücrelerin sürekli izlenmesidir. Genellikle konakçı 6,13’teki dinamik göç ve hayatta kalma süreçleri göz ardı edilerek sadece son nokta ölçümleri yapılır. Bu sınırlamalar, aşılanmış hücrelerin zayıf karakterizasyonuna neden olur ve uzunlamasına değişiklikleri anlamak için yüksek hayvan sayıları gerektirir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, bu çalışmada, indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı nöral progenitör hücreleri, kırmızı ateşböceği lusiferaz ve gelişmiş yeşil floresan proteininden (rFluc-eGFP) oluşan ticari olarak temin edilebilen çift muhabirli lentiviral vektörle dönüştürüyoruz. Bu hücreler stereotaksik intraparankimal enjeksiyon yoluyla fare beynine nakledilir ve 5 hafta boyunca in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanılarak uzunlamasına izlenir. Beyin dokusu toplandıktan sonra, GFP eksprese eden greftlenmiş hücreler tanımlanır ve histolojik beyin bölümlerinde daha da karakterize edilir. Bu yöntem, kemirgen beynindeki in vivo uygulamalar için alternatif dönüştürülebilir hücre kaynaklarına ve nakil yollarına sorunsuz bir şekilde uyarlanabilir. Genel olarak, prosedür fare beyninde greft sağkalımı ve göçü hakkında uzunlamasına bilgi edinmek için değerlidir ve sonraki histolojik karakterizasyonu kolaylaştırır.
İşlevsel iyileşmeye izin vermek için yaralı beynin yenilenmesi karşılanmamış bir zorluk olmaya devam etmektedir. Birçok yenilikçi preklinik yaklaşım, örneğin immün modülasyon19,20, anjiyogenez 1,21,22,23, kan-beyin-bariyer bütünlüğü 2,3,24,25 ve hücre replasmanı 5,26 gibi hedeflemeyi geliştirmiştir. . Özellikle son yıllarda kök hücre teknolojisindeki büyük gelişmeler ve etkin farklılaşma protokolleri nedeniyle hücre bazlı tedaviler beyin için umut verici bir tedavi stratejisi olarak ortaya çıkmıştır15,28. Bu makale, fare beynindeki sinir hücrelerinin nakli ve izlenmesi için değerli bir protokol sunmaktadır. Yöntem, fare beynindeki in vivo uygulamalar için tüm dönüştürülebilir hücre hatları için geçerlidir.
Sunulan kurulum, bir farede insan kökenli nakiller kullanır. Bu nakiller, immünojenite nedeniyle immünkompetan vahşi tip farelerde uzun vadede uygulanabilir değildir. Bu nedenle, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için immün yetmezlikli NSG fareleri kullanılmıştır. Alternatif olarak, immünojenik yönlerin üstesinden gelmek için fare nakillerinin kullanılması tercih edilebilir. İnsan hücrelerinin nakli gerekiyorsa, insanlaştırılmış fare modelleri, greft reddi olasılığını azaltmak için ortaya çıkan bir alternatifi temsil eder29.
EF1α promotor altında ateşböceği lusiferaz ve eGFP’den oluşan ticari bir çift muhabirli viral vektör, nakli görselleştirmek için kullanıldı. Bu promotor, yüksek sinyal yoğunluğu15 elde etmek için seçildi. Bununla birlikte, NPC’lerin yanı sıra, diğer hücre tiplerinin, perisitler30 ve astrositler31 dahil olmak üzere yaralanmadan sonra beyin fonksiyonunu desteklediği gösterilmiştir; Bu nedenle, kullanılan hücre hattına bağlı olarak, diğer promotorlar yüksek ekspresyon seviyelerine ulaşmak için daha uygun olabilir. Ek olarak, CMV gibi transgen promotörlerinin kullanımı, özellikle uzun süreli deneylerde aşağı regülasyona yol açabilir32. Lentiviral vektörün transdüksiyon verimliliği, kullanılan hücre hattına büyük ölçüde bağlıdır ve tek deneyler arasında değişebilir. Bu nedenle, in vivo deneylere başlamadan önce transdüksiyon verimliliği değerlendirilmeli ve deneyler arasındaki transdüksiyon etkinliğindeki varyasyonları düzeltmelidir. Transplantasyonun beyin bölgesi de sinyal gücünü etkiler. Kortikal transplantasyonlar için 6.000 < hücrelik bir tespit sınırına ulaşılmış olsa da, daha derin beyin bölgelerinde, örneğin striatum veya hipokampusta bir sinyal tespit etmek için daha fazla hücre gerekebilir.
Fare beynindeki transplantasyon hacimleri 1-2 μL ile sınırlıdır. Bu nedenle, deneyler için uygun bir hücre numarası belirlemek önemlidir. Daha önce, artan hücre sayılarının, büyük olasılıkla transplantasyon bölgesinde besin ve oksijenin sınırlı mevcudiyeti nedeniyle hayatta kalma oranının azalmasına yol açtığı gözlenmiştir33. İn vivo biyolüminesans görüntüleme, MRG veya BT gibi diğer in vivo görüntüleme yöntemlerine kıyasla nispeten düşük bir uzamsal çözünürlük sağlar. Bu nedenle, aşılanmış hücrelerin kısa göç yolları, sonraki post-hoc analizde yalnızca güvenilir bir şekilde değerlendirilebilir.
Biyolüminesansın mutlak sinyal gücü genellikle nakledilen hücre sayısı ile orantılıdır. Bununla birlikte, greftler daha derin beyin yapılarına nakledilirse veya sinyal gücü in vivo görüntüleme sisteminin doğrusal algılama spektrumunun dışındaysa sinyal gücü azaltılabilir. Şu anda, kan-beyin bariyeri boyunca siklüzyon1 de dahil olmak üzere D-lusiferinden daha verimli penetrasyon sağlamak için yeni substratlar geliştirilmiştir. Bu substratlar, gelecekte aşılanmış hücrelerin tespit sınırını daha da artırabilir18. Genel olarak, bu protokol fare beynindeki greftleri nakletmek ve gözlemlemek için basit, minimal invaziv bir prosedüre izin verir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar RR ve CT, Mäxi Vakfı ve 3R Yetkinlik Merkezi’nin desteğini kabul ediyor.
Viral Transduction | |||
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
Consumables | |||
Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
Microscope cover slips | Product of choice | ||
Microscope slides | Product of choice | ||
Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
Equipment | |||
Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
Heating pad | Product of choice | ||
High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
Microtome | Leica | HM430 | |
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
Pharmaceuticals and Reagents | |||
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
Donkey serum | Product of choice | ||
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ethanol; 70% | Product of choice | ||
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |