نحن نصف عملية زرع البطانة اللبنية للخلايا السلفية العصبية البشرية التي تم نقلها باستخدام ناقل مراسل مزدوج يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر luciferase (GFP) في دماغ الفأر. بعد الزرع ، يتم قياس إشارة luciferase بشكل متكرر باستخدام التلألؤ الحيوي في الجسم الحي والخلايا المطعمة المعبرة عن GFP المحددة في أقسام الدماغ باستخدام المجهر الفلوري.
لطالما كان العلاج الخلوي نموذجا علاجيا ناشئا في البيولوجيا العصبية التجريبية. ومع ذلك ، غالبا ما تعتمد دراسات زرع الخلايا على قياسات نقطة النهاية ، وبالتالي يمكنها فقط تقييم التغيرات الطولية لهجرة الخلايا وبقائها على قيد الحياة إلى حد محدود. توفر هذه الورقة بروتوكولا موثوقا به وطفيف التوغل لزرع الخلايا السلفية العصبية (NPCs) وتتبعها طوليا في دماغ الفأر البالغ. قبل الزرع ، يتم نقل الخلايا باستخدام ناقل فيروسي عدسي يتكون من مراسل حيوي (اليراع – لوسيفيراز) والفلورسنت (البروتين الفلوري الأخضر [GFP]). يتم زرع NPCs في نصف الكرة القشرية اليمنى باستخدام الحقن المجسمة في القشرة الحسية الحركية. بعد الزرع ، تم اكتشاف الخلايا المطعمة من خلال الجمجمة السليمة لمدة تصل إلى خمسة أسابيع (في الأيام 0 و 3 و 14 و 21 و 35) مع حد دقة 6000 خلية تستخدم تصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي . في وقت لاحق ، يتم تحديد الخلايا المزروعة في أقسام الدماغ النسيجية وتتميز كذلك بالتألق المناعي. وبالتالي ، يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة لزرع الخلايا في دماغ الفأر وتتبعها وتحديدها كميا وتوصيفها.
يتمتع دماغ الثدييات بقدرات تجديدية محدودة بعد الإصابة أو المرض ، مما يتطلب استراتيجيات مبتكرة لتعزيز الأنسجة والإصلاح الوظيفي. تركز الاستراتيجيات قبل السريرية على جوانب مختلفة من تجديد الدماغ ، بما في ذلك الحماية العصبية ، أو تكوين الخلايا العصبية ، أو تكوين الأوعية الدموية1،2 ، أو إصلاح حاجز الدم الدماغي3،4 ، أو العلاج الخلوي5،6. يتميز العلاج الخلوي بقدرته على تعزيز العديد من هذه العمليات المؤيدة للإصلاح في وقت واحد. في تجارب زرع الخلايا ، حدث إصلاح الأنسجة من خلال (1) استبدال الخلايا المباشر و (2) إنتاج السيتوكينات مما يؤدي إلى تكوين الأوعية الدموية وتكوين الخلايا العصبية7. وقد سهلت التطورات الأخيرة في تكنولوجيا الخلايا الجذعية تطوير مصادر الخلايا العصبية القابلة للتطوير والمميزة بشكل جيد والتي هي الآن في طور الإعداد للتجارب السريرية (تمت مراجعتها في 7،8،9). على الرغم من أن العلاجات الخلوية قد وصلت إلى المرحلة السريرية لعدد قليل من الأمراض العصبية (على سبيل المثال ، مرض باركنسون10 ، والسكتة الدماغية11 ، وإصابة الحبل الشوكي12) ، إلا أن فعاليتها كانت متغيرة ، وهناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث قبل السريرية لفهم آليات التفاعلات بين الطعم والمضيف.
أحد القيود الرئيسية للعديد من الدراسات قبل السريرية هو التتبع المستمر للخلايا المزروعة داخل المضيف. في كثير من الأحيان يتم إجراء قياسات نقطة النهاية فقط ، مع حذف عمليات الهجرة والبقاء الديناميكية في المضيف 6,13. تؤدي هذه القيود إلى سوء توصيف الخلايا المطعمة وتتطلب أعدادا كبيرة من الحيوانات لفهم التغيرات الطولية. للتغلب على هذه القيود ، في هذه الدراسة ، نقوم بتحويل الخلايا السلفية العصبية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المستمدة من الخلايا العصبية مع ناقل lentiviral مزدوج المراسل متاح تجاريا يتكون من luciferase اليراع الأحمر والبروتين الفلوري الأخضر المحسن (rFluc-eGFP). يتم زرع هذه الخلايا عن طريق الحقن المجسمة intraparenchymal في دماغ الفأر ويتم تتبعها طوليا باستخدام التصوير الحيوي في الجسم الحي على مدى 5 أسابيع. بعد جمع أنسجة المخ ، يتم تحديد الخلايا المطعمة التي تعبر عن GFP وتوصيفها بشكل أكبر في أقسام الدماغ النسيجية. يمكن تكييف هذه الطريقة بسلاسة مع مصادر الخلايا البديلة القابلة للتحويل وطرق الزرع للتطبيقات في الجسم الحي في دماغ القوارض. بشكل عام ، يعد الإجراء ذا قيمة للحصول على معلومات طولية عن بقاء الكسب غير المشروع والهجرة في دماغ الفأر ويسهل التوصيف النسيجي اللاحق.
لا يزال تجديد الدماغ المصاب للسماح بالشفاء الوظيفي يمثل تحديا لم تتم مواجهته. وقد تطورت العديد من الأساليب المبتكرة قبل السريرية التي تستهدف ، على سبيل المثال ، التعديل المناعي19،20 ، وتكوين الأوعية الدموية1،21،22،23 ، وسلامة حاجز الدم الدماغي2،3،24،25 ، واستبدال الخلايا 5،26 . خاصة في السنوات الأخيرة ، ظهرت العلاجات القائمة على الخلايا كاستراتيجية علاج واعدة للدماغ بسبب التقدم الكبير في تكنولوجيا الخلايا الجذعية وبروتوكولات التمايز الفعالة15,28. توفر هذه الورقة بروتوكولا قيما لزرع وتتبع الخلايا العصبية في دماغ الفأر. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على جميع خطوط الخلايا القابلة للتحويل للتطبيقات في الجسم الحي في دماغ الماوس.
يستخدم الإعداد المقدم عمليات زرع من أصل بشري في فأر. عمليات الزرع هذه غير قابلة للحياة على المدى الطويل في الفئران البرية ذات الكفاءة المناعية بسبب المناعة. وبالتالي ، تم استخدام الفئران NSG التي تعاني من نقص المناعة للتغلب على هذا القيد. بدلا من ذلك ، قد يفضل استخدام عمليات زرع الفئران للتغلب على الجوانب المناعية. إذا كانت هناك حاجة إلى زرع الخلايا البشرية ، فإن نماذج الفئران البشرية تمثل بديلا ناشئا لتقليل احتمال رفض الكسب غير المشروع29.
تم استخدام ناقل فيروسي تجاري مزدوج المراسل يتكون من لوسيفيراز اليراع و eGFP تحت محرك EF1α لتصور عمليات الزرع. تم اختيار هذا المحرك الأولي لتحقيق كثافة إشارة عالية15. ومع ذلك ، وبصرف النظر عن NPCs ، فقد ثبت أن أنواع الخلايا الأخرى تعزز وظائف الدماغ بعد الإصابة ، بما في ذلك pericytes30 و astrocytes31 ؛ وبالتالي ، اعتمادا على خط الخلية المستخدم ، قد تكون promotors الأخرى أكثر ملاءمة لتحقيق مستويات تعبير عالية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي استخدام مروجي الجينات المحورة ، مثل CMV ، إلى انخفاض التنظيم ، خاصة في التجارب طويلة الأجل32. تعتمد كفاءة نقل ناقل الفيروسات الوعائية بشدة على خط الخلية المستخدم وقد تختلف بين التجارب الفردية. لذلك ، يجب تقييم كفاءة النقل قبل البدء في التجارب في الجسم الحي وتصحيح الاختلافات في فعالية النقل بين التجارب. تؤثر منطقة الزرع في الدماغ أيضا على قوة الإشارة. على الرغم من تحقيق حد اكتشاف يبلغ <6000 خلية لعمليات زرع القشرة، إلا أنه قد يتطلب المزيد من الخلايا للكشف عن إشارة في مناطق أعمق من الدماغ، على سبيل المثال، المخطط أو الحصين.
تقتصر أحجام الزرع في دماغ الفأر على 1-2 ميكرولتر. لذلك ، من المهم تحديد رقم خلية مناسب للتجارب. وقد لوحظ سابقا أن زيادة أعداد الخلايا يؤدي إلى انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة ، على الأرجح بسبب محدودية توافر العناصر الغذائية والأكسجين في منطقة الزرع33. يوفر التصوير بتقنية التلألؤ الحيوي في الجسم الحي دقة مكانية منخفضة نسبيا مقارنة بطرق التصوير الأخرى في الجسم الحي مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب. لذلك ، لا يمكن تقييم مسارات الهجرة القصيرة للخلايا المطعمة بشكل موثوق به إلا في التحليل اللاحق بعد التخصيص .
تتناسب قوة الإشارة المطلقة للتلألؤ الحيوي بشكل عام مع عدد الخلايا المزروعة. ومع ذلك ، قد يتم تقليل قوة الإشارة إذا تم زرع الطعوم في هياكل أعمق للدماغ أو إذا كانت قوة الإشارة خارج طيف الكشف الخطي لنظام التصوير في الجسم الحي . حاليا ، يتم تطوير ركائز جديدة لضمان اختراق أكثر كفاءة عبر حاجز الدم في الدماغ من D-luciferin ، بما في ذلك cycluc1. قد تزيد هذه الركائز من تحسين حد الكشف عن الخلايا المطعمة في المستقبل18. بشكل عام ، يسمح هذا البروتوكول بإجراء مباشر وطفيف التوغل لزرع ومراقبة الطعوم في دماغ الفأر.
The authors have nothing to disclose.
يعترف المؤلفان RR و CT بالدعم المقدم من مؤسسة Mäxi ومركز الكفاءة 3R.
Viral Transduction | |||
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
Consumables | |||
Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
Microscope cover slips | Product of choice | ||
Microscope slides | Product of choice | ||
Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
Equipment | |||
Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
Heating pad | Product of choice | ||
High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
Microtome | Leica | HM430 | |
NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
Pharmaceuticals and Reagents | |||
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
Donkey serum | Product of choice | ||
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ethanol; 70% | Product of choice | ||
FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |