Metabolik çalışmalar için-kullanılan altında olmuştur güçlü bir omurgalı modeli temsil zebrafish. Burada ölçmek için hızlı bir şekilde tarif<em> In vivo</emBöylece bu organizmanın uygulanabilirliği artan genetik veya farmakolojik olarak manipüle embriyolar arasında farklı mitokondriyal fonksiyon parametrelerinin karşılaştırılması sağlayan gelişmekte zebrafish> metabolik profil,.
Metabolizma alanında büyüyen bir gol mitokondriyal fonksiyon farklı yönleri üzerine genetiğin etkisini belirlemektir. Bu ilişkileri anlamak, diyabet ve obezite gibi mitokondriyal disfonksiyon ile bağlantılı hastalıkların bir dizi için altta yatan neden anlamanıza yardımcı olacaktır. Enstrümantasyon son gelişmeler, hücre hatları veya doku eksplantlar mitokondriyal fonksiyon farklı parametrelerin izlenmesi sağladı. Burada Denizatı biyobilim XF 24 ekstraselüler akı analizörü kullanılarak zebrafish embriyonik gelişim sırasında in vivo mitokondriyal fonksiyon parametrelerinin hızlı ve duyarlı bir analizi için bir yöntem mevcut. Bu protokol Islet Yakalama tek bir embriyo her bir kuyunun yer nerede, biyoenerjetik ölçümü sağlayan mikropleytin dahil kullanır: bazal solunum (i); ATP ciro nedeniyle (ii) bazal mitokondriyal solunum (iii) mitokondriyal solunum; (iv) mitokondriyal Kuplajsız solunum veya prOton sızıntı ve (iv) maksimum solunum. Bu yaklaşım, embriyonik zebrafish solunum parametreleri kullanarak yabani tip ve genetiği değiştirilmiş embriyolar (mutant gen aşırı ekspresyonu veya gen demonte) veya farmakolojik olarak manipüle olanlar arasında mukayese edilebilir. Bu protokol yayılması bu alakalı omurgalı hayvan modelinde in vivo metabolik bozuklukların genetik temeli analiz için yeni araçlar ile araştırmacılar sağlayacağı tahmin edilmektedir.
Zebrafish embriyolar gen işlevi de kolayca bloke veya aktive edilebilir ise Zebra balığı, ileri (TRK mutagenez) ve ters (Tilling, çinko parmak nükleaz hedefli knock-out, morfolino demonte) genetik yaklaşımlar 3,4 hem de köklü bir genetik modeldir kodlanmış ürünler için özel seçici farmakolojik bileşiklerin kullanılması. Dış gelişimi ve küçük boyutları nedeniyle, zebrafish embriyolar metabolik analizi için özel olarak uygundur. Bununla birlikte, metabolik profil ve zebrafish embriyolar in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonun sağlam ölçüm sadece bir ön tanımlama ile, elde 5 rapor edilmemiştir. Denizatı analizi aslında hücre tabanlı metabolik çalışmalar için dizayn edilmiştir ve doğru ve güvenilir sonuçlar 6 vermesi ispat edilmiştir. Zebrafish embriyolar bu yeni metodolojinin uygulama önemli ve metabolik çalışmalar için bu model daha geniş kullanımını artırmak için muhtemeldir.
Bu çalışmada, bazal solunum, maksimal solunum, yedek solunum kapasitesi, ATP ciro ve proton kaçak dahil Denizatı Analizörü kullanılarak zebrafish embriyolar solunum parametreleri bir dizi ölçüm göstermektedir. Ayrıca, bu tür ölçümleri bu durumda lipid birikimi, ve bu test sisteminde kullanılan farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı diğer fizyolojik parametreler ile korele edilebilir bir örnek sağlamaktadır. Genetiği değiştirilmiş embriyoların kullanımı ile birlikte bu metabolizma üzerine etkileyen faktörleri anlamak için güçlü bir deneysel bir platform sağlar.
Mitokondriyal işlev bozukluğu, diyabet mellitus, 7, 8 şişmanlık, multipl skleroz 9, Parkinson hastalıkları 10, Alzheimer hastalığı ve 11 kanserler 12 bir tür olarak pek çok insan hastalığı, karıştığı birlikte bu yeni yöntem için çeşitli uygulamalar vardır. Önemlisi, oböylece vivo solunum ve metabolik profilde önemli fizyolojik görünüm sağlayan, aktif – gibi sitokinler, kalkınma ile ilgili büyüme vb – ur tüm çalışmaları çevresel etkiler in vivo koşullarda gerçekleştirilir. Kimyasal ekranlarında ayrıca rutin vahşi tip ve etkisi solunum, mitokondri fonksiyonu veya metabolizma kolayca Denizatı analyzer kullanarak teşhis edilebileceğini mutant arka zebrafish embriyolar (Şekil 1), yeni ilaç yapılır gibi. Seahorse analizör kullanılarak oluşturulan sonuçlar ek bilgi sağlamak için başka deneyler ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bu tür tür cebpα, Pparα gibi belirli adiposit belirteçleri için in situ hibridizasyon gibi Petrol-Kırmızı Boyama gibi fizyolojik analizi, veya moleküler analizi, PPARy, FAS vb içerebilir
Bu yöntem için bazı sınırlamalar vardır kalır. Biz ve diğerleri ölçüm için oligomycin kullanmak mümkün olmasına rağmengenç embriyoların 60 hpf oligomycin tedavisi daha yaşlı embriyolar 5 (bkz. Şekil 3), üzerine ure ATP üretimi ve proton kaçak verimsiz. Biz yaşlı embriyolar oligomycin gibi kolayca yorumlamak sonuçları imkansız hale genç embriyoların daha yaygın olamaz inanıyoruz. Oligomycin sonuçlar ATP ciro ve bağlantısız solunum nedeniyle solunumun belirlenmesi için zorunlu olduğundan, şu anda eski embriyolar oligomycin yüksek konsantrasyonlarda araştırıyoruz. Bununla birlikte, bu gibi tedaviler antimycin bir bazal solunum, maksimum solunum ve yedek solunum kapasitesi, büyük zebrafish embriyolar yapılabilir, en fazla 68 HPF (gösterilmemiştir) gibi diğer ölçümleri ile, daha uzun etkili olmaya devam etmektedir.
Geçerli Denizatı Analizörü kurulumu kullanarak diğer sınırlılığı da zebrafish embriyolar ve genç larvalar için uygundur böyle de her adacık yakalama plaka içinde fiziksel alandır. Bu nedenle, metabolizma icrayetişkin balık diyete bağlı aşırı şişmanlık üzerinde ic çalışmalar, örneğin, henüz teknik olarak mümkün değildir. Ancak, bu çalışmada böylece olası analizleri kapsamında uzanan, özellikle çocuk ve yetişkin balık için tasarlanan plaka gelişimini teşvik edebilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar mükemmel sürekli hayvancılık bakım sağlamak için Deakin Üniversitesi Zebrafish Tesisi personeli teşekkür etmek istiyorum. YG Alfred Deakin Doktora Sonrası Araştırma Bursu ve Deakin Üniversitesi'nde Merkez Araştırma Grant tarafından desteklenmektedir. SLM bir NHMRC Kariyer Geliştirme Bursu tarafından desteklenmektedir. ACW bir NHMRC etkinleştirilmesi Grant tarafından desteklenmektedir. Tüm yazarlar Deakin Üniversitesi'nde Moleküler ve Tıbbi Araştırma Stratejik Araştırma Merkezi tarafından desteklenmektedir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |