Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra
概要
Pez cebra representan un modelo vertebrado poderosa que ha sido infrautilizado para estudios metabólicos. Aquí se describe una forma rápida para medir la<em> In vivo</em> Metabólico perfil de pez cebra en desarrollo que permite la comparación de diferentes parámetros de la función mitocondrial entre genética o farmacológicamente embriones manipulados, aumentando así la aplicabilidad de este organismo.
Abstract
Una meta que crece en el campo del metabolismo es determinar el impacto de la genética en diferentes aspectos de la función mitocondrial. La comprensión de estas relaciones ayudará a entender la etiología subyacente para una serie de enfermedades relacionadas con la disfunción mitocondrial, tales como la diabetes y la obesidad. Los recientes avances en la instrumentación, ha permitido a la monitorización de parámetros distintos de la función mitocondrial en líneas celulares o explantes de tejido. Aquí presentamos un método para un análisis rápido y sensible de parámetros de la función mitocondrial en vivo durante el desarrollo embrionario del pez cebra mediante el Seahorse biociencia XF 24 analizador de flujo extracelular. Este protocolo utiliza la captura Islet microplacas en un único embrión se coloca en cada pocillo, permitiendo la medición de la bioenergética, incluyendo: (i) la respiración basal, (ii) la respiración mitocondrial basal (iii) la respiración mitocondrial debido a la rotación de ATP; (iv) mitocondrial respiración desacoplada o proton fuga y (iv) de respiración máxima. Al utilizar este enfoque de embriones de pez cebra parámetros de respiración pueden ser comparados entre el tipo salvaje y embriones genéticamente alterados (mutante del gen sobre-expresión de genes o caída) o aquellos manipulados farmacológicamente. Se prevé que la difusión de este protocolo proporcionará a los investigadores con nuevas herramientas para analizar la base genética de los trastornos metabólicos in vivo en este modelo animal vertebrado pertinente.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pez cebra es un modelo genético bien establecido para tanto hacia adelante (ENU mutagénesis) y reversa (Tilling, dedo de zinc nucleasa específica knock-out, desmontables morfolino) enfoques genéticos 3,4, mientras que la función de genes en embriones de pez cebra también puede ser fácilmente bloqueado o activado usando compuestos selectivos farmacológicos específicos para los productos codificados. Debido a su desarrollo externo y pequeño tamaño, embriones de pez cebra son particularmente adecuados para el análisis del metabolismo. Sin embargo, robusta medición de perfil metabólico y la función mitocondrial in vivo en embriones de pez cebra no se ha conseguido, con sólo una descripción preliminar reportado 5. Análisis Seahorse fue diseñado originalmente para los estudios metabólicos basados en células y se ha demostrado que dan resultados precisos y fiables 6. La aplicación de esta nueva metodología a los embriones de pez cebra es significativo, y es probable que aumentar el uso más amplio de este modelo para estudios metabólicos.
En este estudio, hemos demostrado la medición de un rango de parámetros de respiración en embriones de pez cebra utilizando el Analizador de Seahorse, incluyendo la respiración basal, la respiración máxima, la capacidad respiratoria de recambio, el recambio de ATP y las fugas de protones. También proporcionamos un ejemplo de cómo dichas mediciones se pueden correlacionar con otros parámetros fisiológicos, en este caso la acumulación de lípidos, y de la utilización de inhibidores farmacológicos en este sistema de ensayo. En combinación con el uso de embriones genéticamente alterados, lo que proporciona una potente plataforma experimental para la comprensión de los factores que influyen en el metabolismo.
Hay una gran variedad de aplicaciones para esta nueva metodología, con la disfunción mitocondrial está implicada en muchas enfermedades humanas, tales como diabetes mellitus 7, 8 obesidad, esclerosis múltiple 9, enfermedades de Parkinson 10, enfermedad de Alzheimer 11 y algún tipo de cáncer 12. Es importante destacar que, our trabajo se realiza で vivo, donde todas las influencias ambientales – tales como las citoquinas, etc relacionados con el desarrollo del crecimiento – están activas, proporcionando de este modo una vista fisiológicamente relevante en la respiración y el perfil metabólico in vivo. Como las pantallas de químicos también se realiza de manera rutinaria en el tipo salvaje y mutante embriones de pez cebra de fondo (Figura 1), los productos farmacéuticos novedosos que la respiración influencia, la función de las mitocondrias o el metabolismo pueda ser fácilmente identificados con el analizador Seahorse. Los resultados generados utilizando el analizador de Seahorse podría ser usado en conjunción con otros ensayos para proporcionar información adicional. Esto puede incluir el análisis fisiológico, tal como aceite rojo tinción, o análisis molecular, tal como la hibridación in situ para marcadores específicos de adipocitos como cebpα, PPAR, PPAR, FAS etc
Quedan algunas limitaciones a esta metodología. A pesar de que nosotros y otros fueron capaces de utilizar oligomicina a mediure producción de ATP y fuga de protones en embriones jóvenes 5 (ver Figura 3), en embriones mayores de 60 hpf tratamiento oligomicina es ineficiente. Creemos que en los embriones más viejos oligomicina no se puede difundir con la misma facilidad que en los embriones más jóvenes poniendo los resultados imposibles de interpretar. Dado que los resultados oligomicina son obligatorios para la determinación de la respiración debido a la rotación ATP y la respiración no acoplado, actualmente estamos investigando concentraciones más altas de oligomicina para mayores embriones. Sin embargo, la antimicina A tratamientos siguen siendo eficacia más duradera, con otras mediciones, tales como la respiración basal, respiración máxima y la capacidad respiratoria de repuesto, se puede realizar en embriones de pez cebra mayores, hpf hasta 68 (no se muestra).
Otra limitación en el uso de la configuración Seahorse Analyser actual es el espacio físico dentro de cada placa de captura de islote bien, de tal manera que sólo son adecuados para los embriones de pez cebra y larvas jóvenes. Por lo tanto, la realización de Metabolestudios de IC en obesidad inducida por dieta en peces adultos, por ejemplo, no es aún técnicamente factible. Sin embargo, este estudio puede llevar al desarrollo de placas especialmente diseñadas para los juveniles o adultos, ampliando así el alcance de los análisis posibles.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros del personal del Fondo para la Universidad Deakin de pez cebra para proporcionar una excelente atención cría en curso. YG es apoyado por una beca de investigación postdoctoral Alfred Deakin y una Beca de Investigación Central de la Universidad de Deakin. SLM es apoyado por una beca de Desarrollo Profesional NHMRC. ACW es apoyado por una beca NHMRC Habilitación. Todos los autores son apoyadas por el Centro de Investigación de Investigación Molecular y Medicina Estratégica en la Universidad de Deakin.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
参考文献
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