Zebravis een krachtig gewervelde model dat is onder-gebruikt voor metabole studies. Hier beschrijven we een snelle manier om de te meten<em> In vivo</em> Metabole profiel van de ontwikkeling van de zebravis, dat de vergelijking van verschillende mitochondriale functie parameters tussen genetisch of farmacologisch gemanipuleerde embryo's mogelijk maakt, waardoor de toepasbaarheid van dit organisme.
Een groeiende doel op het gebied van metabolisme is het effect van genetica bepalen op verschillende aspecten van mitochondriale functie. Inzicht in deze relaties zal helpen om de onderliggende etiologie voor een reeks van ziekten die verband houden met de mitochondriale dysfunctie, zoals diabetes en obesitas te begrijpen. Recente ontwikkelingen in instrumentatie, heeft de controle van verschillende parameters van mitochondriale functie in cellijnen of weefselexplantaten. Hier presenteren we een methode voor een snelle en gevoelige analyse van mitochondriale functie parameters in vivo tijdens zebravis embryonale ontwikkeling met behulp van de Seahorse bioscience XF 24 extracellulaire flux analyzer. Dit protocol gebruikt de Islet Capture microplaten wanneer een embryo geplaatst in elk putje, waarmee metingen van bio-energetica, waaronder: (i) basale ademhaling, (ii) basale mitochondriale respiratie (iii) mitochondriale respiratie door ATP omzet, (iv) mitochondriale afgekoppeld ademhaling of proton lek en (iv) een maximale ademhaling. Met behulp van deze benadering embryonale zebravis ademhaling parameters kunnen worden vergeleken tussen wild-type en genetisch veranderde embryo's (mutant, gen overexpressie of gen knockdown) of die farmacologisch gemanipuleerd. Verwacht wordt dat de verspreiding van dit protocol zullen de onderzoekers te voorzien van nieuwe tools om de genetische basis van metabole aandoeningen in vivo in deze relevante gewerveld dier model te analyseren.
De zebravis is een gevestigde genetisch model voor zowel vooruit (ENU mutagenese) en achteruit (Tilling, zinkvinger nuclease gerichte knock-out, morfolino knock-down) genetische benaderingen 3,4, terwijl genfunctie in zebravis embryo's kunnen ook eenvoudig worden geblokkeerd of geactiveerd met selectieve farmacologische verbindingen die specifiek zijn voor de gecodeerde producten. Vanwege hun externe ontwikkeling en klein, zebravis embryo's zijn bijzonder geschikt voor metaboolanalyse. Echter, robuuste meting van metabole profiel en mitochondriale functie in vivo in zebravis embryo's niet zijn bereikt, met slechts een voorlopige beschrijving gerapporteerd 5. Seahorse analyse werd oorspronkelijk ontworpen voor cel-gebaseerde metabole studies is aangetoond om nauwkeurige en betrouwbare resultaten 6. De toepassing van deze nieuwe methodologie om zebravis embryo's is significant en waarschijnlijk de bredere gebruik van dit model voor metabole studies te vergroten.
In deze studie tonen we aan het meten van een aantal van de ademhaling parameters in zebravis embryo's met behulp van de Seahorse Analyser, met inbegrip van basale ademhaling, maximale ademhaling, reserve ademhalingscapaciteit, ATP omzet en proton lekkage. Wij ook een voorbeeld van hoe deze metingen gecorreleerd worden met fysiologische parameters, in dit geval lipide accumulatie en het gebruik van farmacologische remmers in dit testsysteem. In combinatie met het gebruik van genetisch veranderde embryo's, biedt dit een krachtig experimenteel platform voor het begrijpen van factoren die van invloed op de stofwisseling.
Er zijn verschillende toepassingen voor deze nieuwe methodologie met mitochondriale dysfunctie geïmpliceerd in veel menselijke ziekten, zoals diabetes mellitus 7, obesitas 8, 9 multiple sclerose, ziekte van Parkinson 10 van Alzheimer 11 en een soort van kanker 12. Belangrijker our werkzaamheden worden uitgevoerd in vivo, waar alle omgevingsinvloeden – zoals cytokinen, ontwikkelingsgerelateerde groei etc – actief, waardoor een fysiologisch relevant beeld in vivo ademhaling en metabole profiel. Als chemische schermen ook routinematig uitgevoerd in wild type en mutante achtergrond zebravis embryo's (Figuur 1) nieuwe geneesmiddelen die invloed ademhaling, mitochondria functie of metabolisme kan gemakkelijk worden geïdentificeerd met de Seahorse analyzer. De resultaten die met de Seahorse analyzer kan worden gebruikt in combinatie met andere assays om aanvullende informatie. Dit kan onder fysiologische analyse, zoals olie-kleuring of moleculaire analyse, zoals in situ hybridisatie voor specifieke adipocyte markers zoals cebpα, PPARa, PPARy, FAS etc.
Er zijn nog een aantal beperkingen aan deze methode. Hoewel wij en anderen waren in staat om oligomycine gebruiken om maatreure ATP productie en proton lek op jonge embryo 5 (zie figuur 3), in embryo's ouder dan 60 hpf oligomycine behandeling is inefficiënt. Wij zijn van mening dat bij oudere embryo's oligomycine niet kan diffunderen zo gemakkelijk dan bij jongere embryo's maken van de resultaten onmogelijk te interpreteren. Omdat de oligomycine resultaten zijn verplicht voor de bepaling van de ademhaling als gevolg van ATP omzet en afgekoppeld ademhaling, zijn we momenteel onderzoek naar hogere concentraties van oligomycine voor oudere embryo's. Echter antimycin A behandelingen effectief blijven langer met andere metingen, zoals basale ademhaling, ademhaling maximum & vrije ademhalingscapaciteit kan worden uitgevoerd in oudere zebravis embryo tot 68 hpf (niet getoond).
Een andere beperking in het gebruik van de huidige Seahorse Analyser setup is de fysieke ruimte binnen elk eilandje capture plaat goed, zodanig dat ze alleen geschikt zijn voor zebravis embryo's en jonge larven. Daarom zal het uitvoeren MetabolIC studies op dieet geïnduceerde obesitas bij volwassen vissen, bijvoorbeeld technisch nog niet haalbaar. Dit kan echter studie vraagt de ontwikkeling van platen speciaal ontworpen voor jeugd of volwassen vissen, waardoor het toepassingsgebied van analyses mogelijk.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de medewerkers van de Deakin University zebravis Facility bedanken voor het verstrekken van uitstekende lopende houderij zorg. YG wordt ondersteund door een Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship en een Central Research Grant van Deakin University. SLM wordt ondersteund door een NHMRC Career Development Fellowship. ACW wordt ondersteund door een NHMRC inschakelen Grant. Alle auteurs worden ondersteund door de Molecular & Medical Research Strategic Research Centre van de Deakin University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |