דג זברה מייצג מודל חוליות חזקה שהיה תחת מנוצל למחקרים מטבוליים. כאן אנו מתארים את הדרך מהירה למדידה<em> In vivo</em> פרופיל המטבולי של דג זברה מתפתח המאפשר השוואה של פרמטרי מיטוכונדריה שונים בין עוברים גנטיים או מניפולציה פרמקולוגית, ובכך להגדיל את הישימות של אורגניזם הזה.
מטרה גוברת בתחום המטבוליזם היא לקבוע את ההשפעה של גנטיקה על היבטים שונים של מיטוכונדריה. הבנת יחסים אלה תעזור להבין את האטיולוגיה הבסיסית למגוון מחלות הקשורות בתפקוד המיטוכונדריה, כמו סוכרת והשמנת יתר. התקדמות במכשור, אפשרה הניטור של פרמטרים שונים של מיטוכונדריה בשורות תאים או הרקמות explants. כאן אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של פרמטרי מיטוכונדריה in vivo במהלך התפתחות עוברית דג הזברה באמצעות מנתח סוסון ים Bioscience XF 24 תאי שטף. פרוטוקול זה משתמש בלכידת איילט microplates בי עובר יחיד יוצב בכל באר, המאפשרת מדידה של bioenergetics, כוללת: (i) הנשמה בסיסית; נשימה (ii) המיטוכונדריה הבזליים נשימה (iii) המיטוכונדריה בשל מחזור ה-ATP; (ד) המיטוכונדריה נשימה כשהתיר או יחסי הציבורoton דליפה ונשימה (iv) מקסימלי. שימוש בפרמטרי גישה זו עוברית דג זברת נשימה ניתן להשוות בין סוג פרוע ועוברים שעברו שינוי גנטי (מוטציה, גן על ביטוי או מציאת גן) או אלה מניפולציות פרמקולוגית. זה צפוי כי הפצתו של פרוטוקול זה תספק לחוקרים בכלים חדשים כדי לנתח את הבסיס הגנטי של הפרעות מטבוליות in vivo במודל של בעלי חיים בעלי חוליות רלוונטי זה.
דג זברה הוא מודל גנטי מבוסס היטב לשניהם קדימה (ENU mutagenesis) והפוך (עבד, אבץ האצבע nuclease ממוקד עקום החוצה, מציאת morpholino) גישה גנטית, 3,4, בעוד תפקוד גן בעוברי דג זברה יכול גם להיחסם בקלות או הופעל שימוש בתרכובות תרופתיות סלקטיביים ספציפיות למוצרים המקודדים. בשל ההתפתחות החיצונית שלהם והגודל קטן, עובר דג הזברה הם מתאימים במיוחד לניתוח מטבולים. עם זאת, מדידה חזקה של פרופיל המטבולי ומיטוכונדריה in vivo בעוברי דג זברה לא הושגה, ורק אחד תיאור ראשוני דיווחה 5. ניתוח סוסון הים תוכנן במקור למחקרים מטבוליים מבוססי תאים והודגם לתת תוצאות מדויקות ואמינות 6. היישום של מתודולוגיה חדשה זו לעוברי דג זברה הוא משמעותי, וסביר להניח כדי להגדיל את השימוש הרחב יותר של מודל זה למחקרים מטבוליים.
במחקר זה, אנו מדגימים מדידה של מגוון פרמטרי נשימה בעוברי דג זברה באמצעות Analyser סוסון הים, כולל הנשמה בסיסית, נשימה מקסימלי, יכולת נשימה פנויה, מחזור ה-ATP ודליפת פרוטון. אנו מספקים גם דוגמה לאופן שיכולות להיות מתואמות עם מדידות כאלה פרמטרים פיסיולוגיים אחרים, בהצטברות שומנים במקרה זה, ושל השימוש במעכבים תרופתיים במערכת assay זה. בשילוב עם השימוש בעוברים גנטיים שהשתנו, זה מספק פלטפורמה ניסיונית רבה עצמה להבנת גורמים המשפיעים על חילוף חומרים.
יש מגוון של יישומים למתודולוגיה חדשה זו, עם תפקוד המיטוכונדריה הוא מעורב במחלות של בני אדם רבות, כגון סוכרת 7 סוכרת, השמנת יתר 8, 9 טרשת נפוצה, פרקינסון 10, אלצהיימר 11 ואיזה סוג של 12 סוגי הסרטן. חשוב לציין, oעבודה מתבצעת ur in vivo, שבו כל ההשפעות הסביבתיות – כגון ציטוקינים וכו ', פיתוח הקשור לצמיחה – הן פעילות, ובכך לספק מבט פיסיולוגי רלוונטי בנשימת vivo ופרופיל מטבולים. כמסכים כימיים גם מבוצעים באופן שגרתי בסוג פרוע ועוברי דג זברה מוטנטים רקע (איור 1), תרופות חדשניות שהשפעת הנשימה, תפקוד המיטוכונדריה או חילוף חומרים יכולה להיות מזוהית בקלות באמצעות מנתח סוסון הים. תוצאות שנוצרו באמצעות מנתח סוסון הים יכולות לשמש בשילוב עם מבחנים אחרים כדי לספק מידע נוסף. זה יכול לכלול ניתוח פיסיולוגי, כגון כתמי שמן אדומים, או ניתוח מולקולרי, כמו כלאה באתרו לסמני adipocyte ספציפיים כגון cebpα, Pparα, Pparγ, FAS וכו '
יש להישאר כמה מגבלות מתודולוגיה זו. למרות שאנו ואחרים היו מסוגלים להשתמש oligomycin לMEAsייצור ה-ATP ויור דליפת פרוטון בעוברים צעירים 5 (ראה איור 3), בעוברים מעל גיל 60 טיפול hpf oligomycin אינו יעיל. אנו מאמינים כי בעוברים מבוגרים oligomycin לא יכול לנטרל בקלות מאשר בעוברים צעירים עושים את התוצאות אי אפשר לפרש. מאחר שתוצאות oligomycin הן חובה לקביעת נשימה עקב מחזור ה-ATP והנשמה נותקה, אנו כרגע בבדיקת ריכוזים גבוהים יותר של עוברים oligomycin למבוגרים. עם זאת, antimycin A טיפולים להישאר יעילים יותר, עם מדידות אחרות, כגון נשימה בסיסית, נשימה מרבית ואת יכולת נשימה פנויה, ניתן לבצע בעוברי דג זברה מבוגרים, עד 68 hpf (לא מוצג).
מגבלה נוספת בבאמצעות הגדרת Analyser סוסון הים הנוכחית היא גם מרחב הפיזי בתוך כל צלחת לכידת איון, כזה שהם מתאימים רק לעוברי דג זברה וזחלים צעירים. לכן, ביצוע metabolמחקרי IC על השמנת דיאטה מושרה בדגים בוגרים, למשל, עדיין לא אפשרי מבחינה טכנית. עם זאת, מחקר זה עשוי להנחות את הפיתוח של צלחות שתוכננו במיוחד לדגים צעירים או מבוגרים, וכך להרחיב את היקף ניתוח אפשרי.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לחברי צוות של מתקן אוניברסיטת דיקין דג הזברה למתן טיפול גידול בעלי מתמשך מצוין. י.ג. נתמך על ידי מלגת אלפרד דיקין דוקטורי מחקר ומענק מחקר מרכזי מאוניברסיטת דיקין. SLM נתמך על ידי מלגת פיתוח קריירת NHMRC. ACW נתמך על ידי גרנט הפעלת NHMRC. כל המחברים נתמכים על ידי המרכז למחקר הרפואי המולקולרי והאסטרטגי מחקר באוניברסיטת דיקין.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |