الزرد الفقاريات تمثل نموذجا القوية التي كانت غير مستغلة للدراسات التمثيل الغذائي. نحن هنا وصف وسيلة سريعة لقياس<em> في الجسم الحي</em> الملف الشخصي التمثيل الغذائي من الزرد النامية التي تسمح للمقارنة بين مختلف معلمات الدالة الميتوكوندريا بين الأجنة وراثيا أو دواء التلاعب، وبالتالي زيادة إمكانية تطبيق هذا الكائن الحي.
وثمة هدف نموا في مجال التمثيل الغذائي هو تحديد تأثير الوراثة على جوانب مختلفة من وظيفة الميتوكوندريا. وفهم هذه العلاقات تساعد على فهم المسببات الكامنة وراء مجموعة من الأمراض المرتبطة مع ضعف الميتوكوندريا، مثل السكري والسمنة. التطورات الحديثة في الأجهزة، وتمكين رصد المعلمات وظيفة الميتوكوندريا متميزة في خطوط الخلايا أو الأنسجة إإكسبلنتس. هنا نقدم طريقة لتحليل السريع وحساسة من المعلمات وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي خلال التنمية الجنينية الزرد باستخدام فرس البحر العلوم البيولوجية XF 24 محلل تدفق خارج الخلية. يستخدم هذا البروتوكول لقطة جزيرة microplates حيث يتم وضع الجنين واحد في كل بئر، مما يسمح للقياس الطاقة الحيوية، بما في ذلك: (ط) التنفس القاعدية، (الثاني) التنفس الميتوكوندريا القاعدية (الثالث) التنفس الميتوكوندريا بسبب دوران ATP، (الرابع) الميتوكوندريا فكت التنفس أو العلاقات العامةأطأن تسرب و(رابعا) الحد الأقصى التنفس. يمكن استخدام هذا النهج التنفس الزرد الجنينية يمكن مقارنة بين المعلمات نوع البرية والأجنة المعدلة وراثيا (متحولة، الإفراط في التعبير الجيني أو ضربة قاضية الجين) أو تلك التلاعب دواء. من المتوقع أن نشر هذا البروتوكول سوف توفر للباحثين مع أدوات جديدة لتحليل الأسس الجينية للاضطرابات التمثيل الغذائي في الجسم الحي في هذا النموذج الحيواني الفقاريات ذات الصلة.
الزرد هو نموذج راسخة الوراثية لكل من الأمام (ENU الطفرات) وعكس (الفلاحة، الزنك الاصبع نوكلياز المستهدفة طرق المغادرة، morpholino ضربة قاضية) النهج الوراثية 3،4، في حين يمكن أيضا وظيفة الجينات في الأجنة الزرد يكون قد تم حظره بسهولة أو تنشيط استخدام المركبات الدوائية انتقائية محددة للمنتجات المشفرة. نظرا لتنميتها الخارجية وصغر حجمها، والأجنة الزرد هي مناسبة خاصة للتحليل الأيض. ومع ذلك، وقياس قوية من الملف التمثيل الغذائي وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي في الأجنة الزرد لم يتحقق، مع واحد فقط وصف الأولية أفادت 5. كان مصمما أصلا للدراسات تحليل فرس البحر الأيض خلية القاعدة وثبت لإعطاء نتائج دقيقة وموثوق بها 6. تطبيق هذه المنهجية الجديدة إلى الأجنة الزرد كبير، ومن المرجح أن تزيد من رقعة استخدام هذا النموذج للدراسات التمثيل الغذائي.
في هذه الدراسة، أن نبرهن قياس مجموعة من المعلمات في التنفس الأجنة الزرد باستخدام محلل فرس البحر، بما في ذلك التنفس القاعدية، والتنفس القصوى، والقدرة التنفسية الغيار، والدوران ATP وتسرب بروتون. كما نقوم بتوفير مثال على الكيفية التي يمكن بها ارتباطا هذه القياسات الفسيولوجية الأخرى مع المعلمات، في هذه الحالة تراكم الدهون، واستخدام مثبطات الدوائية في فحص هذا النظام. جنبا إلى جنب مع استخدام الأجنة وراثيا تغيير، وهذا يوفر منصة قوية لفهم العوامل التجريبية التي تؤثر على عملية التمثيل الغذائي.
وهناك مجموعة متنوعة من التطبيقات لهذه المنهجية الجديدة، مع ضعف الميتوكوندريا هو متورط في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، مثل داء السكري 7، السمنة 8، التصلب المتعدد 9، أمراض باركنسون 10، مرض الزهايمر 11 و نوع من السرطانات 12. الأهم من ذلك، يايتم تنفيذ العمل اور في الجسم الحي، حيث كل التأثيرات البيئية – مثل السيتوكينات وغيرها ذات الصلة بالتنمية النمو – تنشط، وبالتالي توفير وجهة نظر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الجسم الحي التنفس والتمثيل الغذائي الملف. كما يتم أيضا إجراء روتيني شاشات الكيميائية في النوع البري ومتحولة الأجنة الزرد الخلفية (الشكل 1)، والمستحضرات الصيدلانية الرواية التي يمكن التنفس تأثير، وظيفة الميتوكوندريا أو الأيض التعرف عليها بسهولة باستخدام محلل فرس البحر. ويمكن استخدام نتائج إنشاؤها باستخدام محلل فرس البحر جنبا إلى جنب مع غيرها من المقايسات لتقديم معلومات إضافية. وهذا يمكن أن تشمل تحليل الفسيولوجية، مثل النفط تلوين الأحمر، أو تحليل الجزيئي، كما هو الحال في الموقع التهجين لعلامات محددة مثل خلية شحمية cebpα، Pparα، Pparγ، FAS الخ.
لا تزال هناك بعض القيود على هذه المنهجية. على الرغم من أن كنا وغيرها قادرة على استخدام أوليغوميسين إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافلدى عودتهم ATP الإنتاج وتسرب بروتون على الأجنة الشباب 5 (انظر الشكل 3)، في الأجنة أقدم من 60 أوليغوميسين HPF العلاج غير فعال. نعتقد أن أقدم أجنة في أوليغوميسين لا يمكن نشر بسهولة من الأصغر سنا في الأجنة جعل من المستحيل تفسير النتائج. منذ أوليغوميسين النتائج إلزامية لتحديد التنفس بسبب دوران ATP التنفس وفكت، نقوم حاليا بالتحقيق في تركيزات أعلى من أوليغوميسين لكبار السن الأجنة. ومع ذلك، antimycin A العلاجات تبقى فعالة لفترة أطول، مع القياسات الأخرى، مثل التنفس القاعدية، التنفس والقدرة التنفسية القصوى الغيار، لا يمكن أن يؤديها في الأجنة الزرد أقدم، HPF يصل إلى 68 (لا تظهر).
ومن أوجه القصور في استخدام محلل فرس البحر الحالي هو الإعداد المساحة الفعلية داخل كل لوحة القبض على جزيرة جيدا، بحيث تكون مناسبة فقط للأجنة ويرقات اسماك الزرد الشباب. ولذلك، وأداء metabolجيم الدراسات بشأن النظام الغذائي الناجم عن السمنة في الأسماك البالغة، على سبيل المثال، ليس ممكنا من الناحية الفنية حتى الآن. ومع ذلك، قد يدفع هذه الدراسة تطوير لوحات صممت خصيصا لصغار الأسماك أو الكبار مما يؤدي إلى تمديد نطاق التحليلات ممكن.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر موظفي مرفق ديكين اسماك الزرد جامعة لتوفير الرعاية الممتازة تربية مستمرة. ويدعم من قبل YG زمالة ألفرد ديكين أبحاث ما بعد الدكتوراه ومنحة بحثية من جامعة ديكين الوسطى. ويدعم من قبل حركة تحرير السودان زمالة التطوير الوظيفي NHMRC. ويدعم ACW بمنحة تمكين NHMRC. ويدعم جميع الكتاب من قبل مركز البحوث البحوث الاستراتيجية الجزيئية والطبية في جامعة ديكين.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |