Zebrafisch stellen eine leistungsstarke Wirbeltier-Modell, das schon für metabolische Studien nicht ausreichend genutzt hat. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode, um die Messung<em> In vivo</em> Metabolische Profil zu entwickeln Zebrafisch, die den Vergleich verschiedener mitochondrialer Funktion Parameter zwischen gentechnisch oder pharmakologisch manipulierte Embryonen ermöglicht, wodurch die Anwendbarkeit dieses Organismus.
Eine wachsende Ziel im Bereich des Stoffwechsels ist, die Auswirkungen der Genetik auf verschiedene Aspekte der mitochondrialen Funktion zu bestimmen. Das Verständnis dieser Zusammenhänge wird helfen, die zugrunde liegende Ätiologie für eine Reihe von Erkrankungen, die mit mitochondriale Dysfunktion, wie Diabetes und Fettleibigkeit zu verstehen. Jüngste Fortschritte in der Instrumentierung, hat die Überwachung der verschiedenen Parameter der mitochondrialen Funktion in Zelllinien oder Gewebe Explantate aktiviert. Hier präsentieren wir eine Methode für eine schnelle und empfindliche Analysen der mitochondrialen Funktion Parameter in vivo während der Zebrafisch Embryonalentwicklung mit der Seahorse Bioscience XF 24 extrazellulären Fluss-Analysator. Dieses Protokoll nutzt die Islet Capture-Mikrotiterplatten, wo ein einzelner Embryo in jedem gut platziert ist, so dass die Messung der Bioenergetik, einschließlich: (i) Basalatmung; (ii) basal mitochondriale Atmung (iii) die mitochondriale Atmung durch ATP Umsatz; (iv) mitochondriale entkoppelt Atmung oder prOton Leck und (iv) maximale Atmung. Mit diesem Ansatz embryonalen Zebrafisch Atmung Parameter können zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderte Embryonen (Mutante, Gen-Überexpression oder Gen-Knockdown) oder den manipulierten pharmakologisch verglichen werden. Es wird erwartet, dass die Verbreitung dieses Protokolls werden die Forscher mit neuen Tools bieten, um die genetischen Grundlagen von Stoffwechselstörungen in vivo in diesem relevanten Wirbeltier Modell zu analysieren.
Zebrafisch ist ein gut etabliertes genetisches Modell für sowohl vorwärts (ENU Mutagenese) und rückwärts (Tilling, Zinkfinger-Nuclease gezielte Knock-out-, Morpholino Knockdown) genetische Ansätze 3,4, während Genfunktion beim Zebrafisch Embryonen können auch einfach blockiert oder aktiviert werden Verwendung selektiver pharmakologischen Verbindungen spezifisch für den codierten Produkte. Aufgrund ihrer externen Entwicklung und geringen Größe sind Zebrafischembryonen besonders geeignet für metabolische Analyse. Allerdings hat sich das robuste Messung der metabolischen Profils und die Funktion der Mitochondrien in vivo in Zebrafisch-Embryonen nicht erreicht wurde, mit nur einer vorläufigen Beschreibung berichtete 5. Seahorse Analyse wurde ursprünglich für zellbasierte metabolischen Untersuchungen ausgelegt und hat sich gezeigt, um genaue und zuverlässige Ergebnisse 6. Die Anwendung dieser neuen Methode zur Zebrafisch-Embryonen ist bezeichnend, und wahrscheinlich die breitere Nutzung dieses Modells für metabolische Studien zu erhöhen.
In dieser Studie zeigen wir, Messung einer Reihe von Atmung Parameter in Zebrafisch-Embryonen mit dem Seahorse Analyser, einschließlich Basalatmung, maximal Atmung, Freizeit Atemkapazität, ATP Umsatz und Protonen Leckage. Wir stellen auch ein Beispiel, wie solche Messungen können mit anderen physiologischen Parameter, in diesem Fall Lipidakkumulation und der Verwendung pharmakologischer Inhibitoren in diesem Testsystem korreliert werden. In Kombination mit dem Einsatz von genetisch veränderten Embryonen, stellt dies eine starke experimentelle Plattform für das Verständnis Einflussfaktoren auf den Stoffwechsel.
Es gibt eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für diese neue Methodik, mit mitochondrialer Dysfunktion ist in vielen menschlichen Erkrankungen, wie Diabetes mellitus 7, 8 Fettleibigkeit, Multipler Sklerose 9, Parkinson-Krankheiten 10, Alzheimer 11 und irgendeine Art von Krebserkrankungen 12 gebracht. Wichtig ist, owie Zytokine, entwicklungsbezogenen Wachstum usw. – – ur Arbeit wird in vivo, wo alle Umwelteinflüsse durchgeführt aktiv sind, wodurch eine physiologisch relevante Sicht in vivo Atmung und metabolische Profil. Als chemische Bildschirme werden auch routinemäßig in Wildtyp und Mutante Hintergrund Zebrafischembryonen (Abbildung 1), neuartige Medikamente, die Einfluss auf die Atmung, Mitochondrien-Funktion oder Stoffwechsel leicht identifiziert werden konnte mit der Seahorse-Analysator durchgeführt. Die Ergebnisse unter Verwendung der Seahorse-Analysator könnte in Verbindung mit anderen Assays verwendet werden, um zusätzliche Informationen bereitzustellen. Dazu kann auch physiologische Analyse, wie Öl-Rot-Färbung oder der molekularen Analyse, wie in situ Hybridisierung für spezifische Marker wie Adipozyten cebpα, PPARalpha, PPAR &ggr;, FAS usw.
Es bleiben jedoch einige Einschränkungen zu dieser Methodik. Obwohl wir und andere konnten Oligomycin zum Messen verwendenure ATP-Produktion und Proton Leck auf junge Embryonen 5 (siehe Abbildung 3), in Embryonen älter als 60 hpf Oligomycin Behandlung ist ineffizient. Wir glauben, dass bei älteren Embryonen Oligomycin nicht so leicht als bei jüngeren Embryonen machen die Ergebnisse nicht zu interpretieren diffundieren. Da die Ergebnisse Oligomycin zwingend zur Bestimmung der Atmung durch ATP Umsatz und ungekoppelten Atmung sind, untersuchen wir derzeit höhere Konzentrationen an Oligomycin für ältere Embryonen. Allerdings bleiben Antimycin A Behandlungen wirksam länger, mit anderen Messungen wie Basalatmung, maximale Atmung und Ersatz Atemkapazität können bei älteren Zebrafischembryonen durchgeführt werden, bis zu 68 hpf (nicht dargestellt).
Eine weitere Einschränkung bei der Verwendung der aktuellen Seahorse Analyser Setup ist der physische Raum innerhalb der einzelnen Insel Fangplatte gut, so dass sie nur für Zebrafisch Embryonen und jungen Larven sind. Daher Durchführung metabolic Studien über ernährungsbedingte Fettleibigkeit bei erwachsenen Fische, zum Beispiel, ist technisch noch nicht machbar. Allerdings kann diese Studie fordert die Entwicklung von Platten speziell für jugendliche oder erwachsene Fische entwickelt, wodurch der Anwendungsbereich der Analysen möglich.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Deakin University Zebrafisch Facility for eine ausgezeichnete laufenden Tierhaltung Pflege danken. YG wird durch ein Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship und Central Research Grant von Deakin University unterstützt. SLM wird durch eine NHMRC Career Development Fellowship unterstützt. ACW wird von einem NHMRC Aktivieren Stipendium unterstützt. Alle Autoren werden von der Molecular & Medical Research Strategic Research Centre an der Deakin University unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |