Sıkı bağlamak, Yeşil Floresan Protein (GFP) etiketli kültür hücreleri proteinlerin hareketliliği ölçmek için kullanılır olmuştur. Biz photobleaching sonra floresan kurtarma yüzdesi analiz ederek, GFP mobil / hareketsiz kesirler inceledi. Bu çalışmada, sıkı bağlamak hipokampal nöronlar, dikenler yapıldı.
Sıkı bağlamak GFP etiketli proteinler hareketliliği ölçmek için kullanılır olmuştur. , Güçlü bir uyarım lazer kullanarak, bir GFP etiketli proteinin floresan ilgi bölgede ağartılmış. Bölge bölge dışından ağartılmamış GFP etiketli protein ilgi bölgeye yayılır floresan kurtarır. Protein hareketlilik floresan iyileşme oranı ölçerek analiz edilir. Bu teknik, protein hareketlilik ve devir hızı karakterize etmek için kullanılabilir.
Bu çalışmada, kültür hipokampal nöronlarda (gelişmiş yeşil flüoresan protein) EGFP vektör ifade eder. Zeiss 710 konfokal mikroskop kullanarak, tek bir omurga GFP proteinin floresan sinyal photobleach ve sonra photobleaching sonra floresan kurtarma kaydı zaman atlamalı görüntüleri çekmek. Son olarak, ImageJ ve GraphPad yazılımları kullanarak görüntüleme verileri analiz ederek, dikenler, GFP mobil ve sabit kesirler yüzdesi tahmin ediyoruz.
Bu sıkı bağlamak protokolünün yanı verilerini analiz etmek için nasıl bir temel sıkı bağlamak deneyi gerçekleştirmek için nasıl gösterir.
In vivo ve in vitro 1-2 çalışmalar sıkı bağlamak analiz geniş kullanılmıştır. Bu teknik yaygın GFP kullanır füzyon proteinleri aynı zamanda kırmızı alg füzyon proteinleri 3 rağmen. Bu analiz, duyarlı ve GFP-etiketli proteinlerin hareketliliği karakterize etmek için kullanılabilir.
Anlamlı sıkı bağlamak analiz üretmek için, önce ve sıkı bağlamak deney sırasında gereksiz photobleaching önlemek için önemlidir. Bunu başarmak için iki yol vardır. İlk olarak, arama ve deneysel nöron gözlemlemek süreci hızlı olmalıdır. Özellikle, uzun bir süre 100X amacı ile nöronların gözlem önemli ölçüde floresan beyazlatıcılar. İkincisi, yüksek lazer gücü ve sık sık tarama genellikle photobleaching olasılığını artırır. Bu nedenle, bir kontrol bölgede photobleaching oranını hesaplamak ve ardından deneysel bölgede sıkı bağlamak eğrisi normalleştirmek için gerekli olacaktır. Normalizasyon yöntemi protokol tarif edilmiştir (Detaylar için adım 3,3-3,5 bakınız).
Photobleaching adım, aynı zamanda, iyi bir sıkı bağlamak sonuç sağlanması için kritik öneme sahiptir. Bu deneyde, çamaşır suyu,% 100 lazer iletim ilgi 10 kat omurga. Bu durum, çamaşır suyu, sabit bir hazırlık arka plan seviyesi bir omurga floresan yeterli. Böylece, photobleaching sonra 0 saniye arka planı olarak aynı sayıda floresan yoğunluğunu ayarlayın. İlk tarama hızına bağlı olarak, önemli miktarda bir floresan kurtarma zaten ilgi protein son derece mobil tespit olabilir.
Birçok floresan protein probları sıkı bağlamak protein dinamiklerini incelemek için geliştirilmiştir. Tamamlayıcı bir yaklaşım photoactivatable GFP (PA-GFP), ya da photoconvertible türevleri, örneğin. Sıkı bağlamak tekniği ile birlikte, bu araçları, canlı hücre görüntüleme çalışmaları 4-6 için vazgeçilmez olma .
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü (NIDCD) İntramural Programı tarafından desteklenmiştir.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |