FRAP è stato utilizzato per quantificare la mobilità di Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteine in cellule in coltura. Abbiamo esaminato le frazioni mobile / immobile della GFP, analizzando la percentuale di recupero di fluorescenza dopo photobleaching. In questo studio, FRAP è stato effettuato a dorso di neuroni dell'ippocampo.
FRAP è stato utilizzato per quantificare la mobilità dei GFP-tagged proteine. Utilizzando un laser forte eccitazione, la fluorescenza di una proteina GFP-tagged è sbiancato nella regione di interesse. La fluorescenza della regione recupera quando il greggio GFP-tagged proteine al di fuori della regione diffonde nella regione di interesse. La mobilità della proteina viene poi analizzata misurando il tasso di fluorescenza di recupero. Questa tecnica potrebbe essere usata per caratterizzare la mobilità proteine e tasso di turnover.
In questo studio, esprimiamo la (enhanced green fluorescent protein) vettore EGFP in colture di neuroni dell'ippocampo. Utilizzando il microscopio confocale Zeiss 710, abbiamo photobleach il segnale di fluorescenza della proteina GFP in una sola colonna vertebrale, e poi prendere le immagini lasso di tempo per registrare il recupero di fluorescenza dopo photobleaching. Infine, si stima la percentuale di frazioni mobile e immobile della GFP in spine, analizzando i dati di imaging con ImageJ e software GraphPad.
Questo protocollo FRAP mostra come eseguire un esperimento di base FRAP e come analizzare i dati.
Analisi FRAP è stato ampiamente utilizzato in vivo e in vitro 1-2 studi. Questa tecnica utilizza comunemente GFP proteine di fusione , anche se potrebbe anche usare proteine di fusione alga rossa 3. Questa analisi è sensibile e può essere utilizzato per caratterizzare la mobilità dei GFP-tagged proteine.
Per produrre analisi significativa FRAP, è importante evitare inutili photobleaching prima e durante l'esperimento FRAP. Ci sono due modi per raggiungere questo obiettivo. In primo luogo, la procedura per ricercare e osservare il neurone sperimentale dovrebbe essere veloce. In particolare, l'osservazione di neuroni con un obiettivo 100X per lungo tempo schiarisce in modo significativo la fluorescenza. In secondo luogo, il potere e la scansione laser ad alta frequenza spesso aumentano la possibilità di photobleaching. Quindi, sarà necessario per calcolare il tasso photobleaching in una zona di controllo e poi normalizzare la curva FRAP nella regione sperimentale. Il metodo di normalizzazione è stato descritto nel protocollo (vedere il passaggio 3,3-3,5 per i dettagli).
Il passo fotodecolorazione è inoltre fondamentale per garantire buoni risultati FRAP. In questo esperimento, abbiamo candeggina la colonna vertebrale di interesse 10 volte al 100% di trasmissione laser. Questa condizione è sufficiente per sbiancare la fluorescenza di una spina dorsale a livello di fondo in un preparato fisso. Così, abbiamo fissato l'intensità di fluorescenza allo stesso numero da sfondo a 0 secondi dopo photobleaching. A seconda della velocità della prima scansione, una quantità significativa di recupero fluorescenza potrebbe essere già rilevato quando la proteina di interesse è molto mobile.
Molte sonde proteina fluorescente sono stati sviluppati per studiare la dinamica delle proteine con FRAP. Un approccio complementare è, per esempio, per utilizzare photoactivatable GFP (GFP-PA), o varianti photoconvertible. Insieme con la tecnica FRAP, questi strumenti stanno diventando indispensabile per gli studi di imaging cellulare dal vivo 4-6.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione (dell'NIDCD) Programma Intramural.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |