FRAP se ha utilizado para cuantificar la movilidad de la proteína verde fluorescente (GFP) de etiquetado proteínas en células cultivadas. Se examinaron las fracciones móviles / inmóviles de la GFP mediante el análisis del porcentaje de recuperación después de fluorescencia photobleaching. En este estudio, FRAP llevó a cabo en las espinas de las neuronas del hipocampo.
FRAP se ha utilizado para cuantificar la movilidad de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas. El uso de un láser de excitación fuerte, la fluorescencia de la proteína GFP-etiquetados se blanquea en la región de interés. La fluorescencia de la región se recupera cuando el crudo de proteína GFP-etiquetados desde fuera de la región se difunde en la región de interés. La movilidad de la proteína se analiza mediante la medición de la tasa de recuperación de fluorescencia. Esta técnica podría ser usada para caracterizar la movilidad de la proteína y la tasa de rotación.
En este estudio, que expresan el vector (aumento de proteína verde fluorescente) EGFP en cultivos de neuronas del hipocampo. Usando el microscopio confocal Zeiss 710, que photobleach la señal de fluorescencia de la proteína GFP en una sola columna, y luego tomar imágenes de lapso de tiempo para registrar la recuperación de fluorescencia después de photobleaching. Por último, estimar el porcentaje de fracciones móviles e inmóviles de la GFP en las espinas, mediante el análisis de los datos de imagen usando ImageJ y softwares Graphpad.
Este protocolo FRAP muestra cómo realizar un experimento FRAP básica, así como la forma de analizar los datos.
Análisis FRAP ha sido ampliamente utilizado in vivo e で vitro estudios 1-2. Esta técnica utiliza comúnmente GFP proteínas de fusión , aunque también se podría utilizar el rojo proteínas de fusión alga 3. Este análisis es sensible y puede ser utilizado para caracterizar la movilidad de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas.
Para producir el análisis FRAP sentido, es importante para evitar photobleaching innecesarios antes y durante el experimento FRAP. Hay dos maneras de lograr esto. En primer lugar, el proceso de buscar y observar la neurona experimental debe ser rápida. Sobre todo, la observación de las neuronas con un objetivo 100X durante mucho tiempo significativamente blanquea la fluorescencia. Segunda potencia, y el escaneo láser de alta frecuencia a menudo aumentan la posibilidad de photobleaching. Por lo tanto, será necesario calcular la tasa de photobleaching en una región de control y normalización de la curva del FRAP en la región experimental. El método de normalización se ha descrito en el protocolo (ver paso 3.3-3.5 para más detalles).
El paso photobleaching también es fundamental para garantizar buenos resultados FRAP. En este experimento, blanqueador de la columna vertebral de interés 10 veces al 100% de transmisión de láser. Esta condición es suficiente para blanquear la fluorescencia de una columna a nivel de base en una preparación fija. Por lo tanto, ajustar la intensidad de fluorescencia para el mismo número que de fondo a 0 segundos después de photobleaching. Dependiendo de la velocidad de la primera exploración, una cantidad importante de recuperación de fluorescencia ya puede ser detectado cuando la proteína de interés es muy móvil.
Muchas sondas de la proteína fluorescente se han desarrollado para estudiar la dinámica de las proteínas con el FRAP. Un enfoque complementario es, por ejemplo, para utilizar fotoactivables GFP (PA-GFP), o variantes fotoconvertible. Junto con la técnica FRAP, estas herramientas son cada vez más imprescindible para vivir estudios de células de imágenes 4.6.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Desórdenes de la Comunicación (NIDCD) Programa Intramural.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |