وقد استخدمت لتحديد FRAP تنقل الإسفار البروتين الأخضر (GFP) الموسومة البروتينات في الخلايا المستزرعة. درسنا الكسور متنقلة / متحركة للGFP من خلال تحليل نسبة الانتعاش بعد photobleaching مضان. في هذه الدراسة ، تم تنفيذ FRAP في العمود الفقري من الخلايا العصبية قرن آمون.
وقد استخدمت لتحديد FRAP تنقل GFP الموسومة البروتينات. باستخدام ليزر قوية الإثارة ، هو ابيض ومضان من البروتين GFP الموسومة في المنطقة من الفائدة. ومضان في المنطقة عندما يتعافى غير مقصور GFP الموسومة البروتين من خارج منطقة ينتشر في المنطقة من الفائدة. ثم يتم تحليل التنقل من البروتين عن طريق قياس معدل الاسترداد مضان. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد خصائص التنقل البروتين ومعدل الدوران.
في هذه الدراسة ، فإننا نعرب عن ناقلات EGFP (بروتين الفلورية الخضراء المعززة) في الخلايا العصبية الحصين مثقف. باستخدام مجهر زايس 710 مبائر ، ونحن photobleach إشارة مضان من البروتين GFP في العمود الفقري واحدة ، ومن ثم التقاط صور الفاصل الزمني لتسجيل انتعاش بعد photobleaching مضان. وأخيرا ، فإننا نقدر أن نسبة الكسور المتنقلة وغير متحرك في GFP في العمود الفقري ، من خلال تحليل البيانات باستخدام التصوير ImageJ Graphpad والبرمجيات.
هذا البروتوكول FRAP يوضح كيفية إجراء التجربة FRAP الأساسية وكذلك كيفية تحليل البيانات.
وقد تم استخدام التحليل FRAP نطاق واسع في الجسم الحي والدراسات في المختبر 1-2. هذه التقنية تستخدم عادة GFP البروتينات الانصهار ، على الرغم من أنه يمكن أيضا استخدام البروتينات الانصهار الطحالب الحمراء 3. هذا التحليل هو حساس ويمكن استخدامها لوصف حركة GFP الموسومة البروتينات.
لإنتاج معنى FRAP التحليل ، فإنه من المهم تجنب photobleaching لا لزوم لها قبل وخلال التجربة FRAP. هناك طريقتان لتحقيق ذلك. أولا ، ينبغي لهذه العملية للبحث ومراقبة الخلايا العصبية التجريبية تكون سريعة. خاصة ، ورصد الخلايا العصبية مع الهدف 100X لفترة طويلة بشكل ملحوظ التبييض مضان. الثانية ، قوة الليزر عالية والمسح الضوئي متكررة كثيرا ما تزيد من احتمال photobleaching. وبالتالي ، سيكون من الضروري لحساب معدل photobleaching في منطقة التحكم ثم تطبيع منحنى FRAP في المنطقة التجريبية. وقد وصفت طريقة تطبيع في البروتوكول (راجع الخطوة 3،3-3،5 للحصول على التفاصيل).
الخطوة photobleaching أمر بالغ الأهمية أيضا لضمان تحقيق نتائج جيدة FRAP. في هذه التجربة ، ونحن التبييض العمود الفقري من الفائدة 10 مرات في 100 ٪ انتقال الليزر. هذا الشرط يكفي لتبييض مضان من العمود الفقري على مستوى الخلفية في إعداد الثابتة. وبالتالي ، وضعنا كثافة مضان لنفس العدد في الخلفية 0 ثانية بعد photobleaching. اعتمادا على سرعة الفحص الأولى ، قد بالفعل قدرا كبيرا من الانتعاش مضان عندما يتم الكشف عن هذا البروتين من الفائدة هو كثيري التنقل.
وقد وضعت العديد من المجسات بروتين فلوري لدراسة ديناميات البروتين مع FRAP. نهج تكميلية ، على سبيل المثال ، لاستخدام photoactivatable GFP (PA – GFP) ، أو متغيرات photoconvertible. جنبا إلى جنب مع تقنية FRAP ، أصبحت هذه الأدوات التي لا غنى عنها للعيش دراسات التصوير الخلية 4-6.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى (NIDCD) البرمجة الجماعية.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |