FRAP wurde verwendet, um die Mobilität von grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierter Proteine in kultivierten Zellen zu quantifizieren. Wir untersuchten die mobile / immobile Fraktionen der GFP durch die Analyse der Fluoreszenz-Recovery-Anteil nach Ausbleichen. In dieser Studie wurde FRAP am Rücken von Hippocampus-Neuronen durchgeführt.
FRAP wurde verwendet, um die Mobilität von GFP-markierten Proteine zu quantifizieren. Mit einer starken Anregung Laser wird die Fluoreszenz einer GFP-markierten Proteins in der Region von Interesse gebleicht. Die Fluoreszenz der Region erholt, wenn die ungebleichten GFP-markierten Proteins von außerhalb der Region diffundiert in die Region von Interesse. Die Mobilität der Protein wird dann durch Messung der Fluoreszenz Recovery Rate analysiert. Diese Technik könnte verwendet werden, um Protein-Mobilität und Fluktuation zu charakterisieren.
In dieser Studie, drücken wir die (Enhanced Green Fluorescent Protein) EGFP-Vektor in kultivierten Hippocampus-Neuronen. Mit dem Zeiss 710 konfokalen Mikroskop, photobleach wir das Fluoreszenzsignal des GFP-Protein in einem einzigen Wirbelsäule, und dann nehmen Zeitreihen-Aufnahmen der Fluoreszenz recovery after photobleaching aufzunehmen. Schließlich schätzen wir den Anteil der mobilen und immobilen Fraktionen der GFP in Stacheln, durch die Analyse der Bilddaten mit ImageJ und Graphpad Software.
Das FRAP-Protokoll zeigt, wie eine grundlegende FRAP-Experiment und wie die Daten zu analysieren durchzuführen.
FRAP-Analyse wurde im Großen und Ganzen in vivo und in vitro 1-2 Studien verwendet. Diese Technik allgemein verwendet GFP Fusionsproteine , obwohl es auch könnte Rotalge Fusion Proteinen 3. Diese Analyse ist empfindlich und kann verwendet werden, um die Mobilität von GFP-markierten Proteine zu charakterisieren.
Um zu aussagekräftigen FRAP-Analyse ist es wichtig, unnötige photobleaching vor und während der FRAP-Experiment zu vermeiden. Es gibt zwei Möglichkeiten, dies zu erreichen. Zunächst sollte das Verfahren zu suchen und zu beobachten, die experimentelle Neuron schnell sein. Besonders die Beobachtung von Neuronen mit einem 100x-Objektiv für eine lange Zeit deutlich bleicht die Fluoreszenz. Zweitens hoher Laserleistung und häufiges Scannen oft die Möglichkeit erhöhen Ausbleichen. Daher wird es notwendig sein, die photobleaching Rate in einer Kontrollregion berechnen und dann normalisieren die FRAP-Kurve in der experimentellen Region. Die Normalisierung der Methode wurde in das Protokoll beschrieben worden (siehe Schritt 3,3-3,5 für Details).
Das Ausbleichen der Schritt ist auch entscheidend für eine gute FRAP Ergebnisse. In diesem Experiment, Bleichmittel wir die Wirbelsäule von Interesse 10-mal bei 100% Laser-Übertragung. Diese Bedingung ist hinreichend zum Bleichen der Fluoreszenz einer Wirbelsäule in den Hintergrund Ebene in eine feste Zubereitung. So setzen wir die Fluoreszenz-Intensität auf die gleiche Anzahl als Hintergrund bei 0 Sekunden nach dem Bleichen. Abhängig von der Geschwindigkeit des ersten Zyklus könnte eine erhebliche Menge an Fluoreszenz Erholung bereits erkannt, wenn das Protein von Interesse ist sehr mobil sein.
Viele fluoreszierende Protein-Sonden wurden entwickelt, um Protein-Dynamik mit FRAP-Studie. Ein komplementärer Ansatz ist zum Beispiel, um photoaktivierbaren GFP (PA-GFP) oder Photokonvertierbare Varianten verwenden. Zusammen mit FRAP-Technik sind diese Werkzeuge immer unentbehrlicher für Live Cell Imaging-Studien 4-6.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom National Institute on Taubheit und andere Communication Disorders (NIDCD) Intramural Programm unterstützt.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
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35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |