FRAP is gebruikt om de mobiliteit van de groene fluorescentie Protein (GFP)-gemerkte eiwitten in gekweekte cellen te kwantificeren. We hebben de mobiele / immobiele fracties van de GFP onderzocht door het analyseren van de fluorescentie herstel na fotobleken percentage. In deze studie werd uitgevoerd op FRAP stekels van hippocampale neuronen.
FRAP is gebruikt om de mobiliteit van GFP-gemerkte eiwitten te kwantificeren. Met behulp van een sterke excitatie laser wordt de fluorescentie van een GFP-gelabelde eiwit gebleekt in de regio van belang. De fluorescentie van de regio zich herstelt wanneer de ongebleekte GFP-gelabelde eiwit van buiten de regio verspreidt in de regio van belang. De mobiliteit van het eiwit wordt vervolgens geanalyseerd door het meten van de fluorescentie recovery rate. Deze techniek kan worden gebruikt om eiwit-mobiliteit en omloopsnelheid te karakteriseren.
In deze studie, wij uitdrukking aan de (verbeterde green fluorescent protein) EGFP vector in gekweekte hippocampale neuronen. Met behulp van de Zeiss 710 confocale microscoop, we photobleach de fluorescentie-signaal van het GFP-eiwit in een wervelkolom, en neem dan een time lapse beelden naar de fluorescentie herstel na fotobleken te nemen. Tenslotte, schatten we het percentage van de mobiele en immobiele fracties van de GFP in stekels, door het analyseren van de gegevens met behulp van imaging ImageJ en GraphPad software.
Dit FRAP protocol laat zien hoe een basis FRAP experiment uit te voeren, alsook hoe de gegevens te analyseren.
FRAP analyse is algemeen gebruikt in vivo jp in vitro studies 1-2. Deze techniek maakt gebruik van het algemeen GFP fusie-eiwitten , maar het kan ook gebruik maken van rode alg fusie-eiwitten 3. Deze analyse is gevoelig en kan gebruikt worden om de mobiliteit van de GFP-gemerkte eiwitten te karakteriseren.
Voor de productie van zinvolle FRAP analyse, is het belangrijk om onnodige fotobleken te vermijden voor en tijdens de FRAP experiment. Er zijn twee manieren om dit te bereiken. Ten eerste moet het proces om te zoeken en te observeren de experimentele neuron te snel. Vooral observatie van neuronen met een 100x objectief voor een lange tijd bleekmiddelen aanzienlijk fluorescentie. Ten tweede, een hoog laservermogen en frequent te scannen vergroten vaak de mogelijkheid van fotobleken. Zo zal het nodig zijn om de fotobleken tarief in een controlegebied vervolgens berekenen en de FRAP curve in de experimentele regio te normaliseren. Het normaliseren methode is beschreven in het protocol (zie stap 3,3-3,5 voor details).
De fotobleken stap is ook kritisch voor het waarborgen van goede FRAP resultaten. In dit experiment, we bleekwater de ruggengraat van de rente 10 keer op 100% laser transmissie. Deze voorwaarde is voldoende om het bleken van de fluorescentie van een ruggengraat naar achtergrondniveau in een vaste voorbereiding. Zo zetten we de fluorescentie-intensiteit op hetzelfde aantal als achtergrond op 0 seconden na fotobleken. Afhankelijk van de snelheid van de eerste scan, kan een aanzienlijke hoeveelheid fluorescentie herstel al worden gedetecteerd wanneer het eiwit van belang is zeer mobiel.
Veel fluorescerend eiwit probes zijn ontwikkeld voor het eiwit dynamica studie met FRAP. Een aanvullende benadering is, bijvoorbeeld, om te gebruiken fotoactiveerbare GFP (PA-GFP) of photoconvertible varianten. Samen met FRAP techniek worden deze tools steeds onmisbaar voor live cell imaging studies 4-6.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het National Institute on Doofheid en andere communicatie stoornissen (NIDCD, toont) Intramurale Program.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |