İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı
Summary
Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.
Abstract
Çift iplikçik kopmaları (DSB’ler), hücre çekirdeğinde meydana gelebilecek en ciddi lezyonlardan biridir ve onarılmazsa, kanser de dahil olmak üzere ciddi sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, hücreye DSB’leri onarmak için karmaşık mekanizmalar sağlanır ve bu yollar Ser-139 (yani γH2AX) ve p53 bağlayıcı protein 1’de (53BP1) fosforile edilmiş formunda histon H2AX’i içerir. Her iki protein de DSB’lerin bölgelerinde odaklar oluşturabildiğinden, bu belirteçlerin tanımlanması hem DSB’leri hem de onarım kinetiğini incelemek için uygun bir yöntem olarak kabul edilir. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumuna yol açan moleküler süreçlere göre, iki DNA hasar belirtecinin aynı anda tespiti ile DSB’lerin nicelleştirilmesine izin veren alternatif bir yaklaşım oluşturmak için DSB’lerin yakınındaki ko-lokalizasyonlarını araştırmak daha yararlı olabilir. Bu nedenle, bu protokol, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı, ikili immünofloresansta γH2AX ve 53BP1 odaklarının varlığı yoluyla değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB’lerin onarım kinetiğini incelemek için bir ön girişim olarak, zaman içinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının sayısındaki değişimi de tanımladık.
Introduction
DNA hasarı, hücresel oksidatif metabolizma tarafından üretilen ROS veya hem kimyasallar hem de fiziksel1 gibi eksojen olabilen ajanlar tarafından sürekli olarak indüklenir. En zararlı lezyonlar arasında, çift iplikçik kırılmaları (DSB’ler) genomik instabiliteye katkıda bulunmada temel bir rol oynar, çünkü bunlar karsinogenez sürecini başlatabilen kromozom anormalliklerine neden olurlar. Böylece hücrelere DSB’lerin onarımı2’nin karmaşık ve verimli mekanizmaları sağlanır.
Bir DSB meydana geldiğinde, hücre, MRE11 / RAD50 / NBS1 kompleksi ile birlikte, hücre döngüsü3’ü yavaşlatan veya durduran diğer proteinleri aktive etmek için ATM veya ATR kinazların işe alındığı DNA hasar yanıtını (DDR) tetikler. Bu kinazların temel bir hedefi, DSB’lerden (yani γH2AX) birkaç megabaz içinde Ser-139 üzerinde fosforile edilen histon H2AX’tir, böylece diğerlerinin yanı sıra BRCA1 ve p53 bağlayıcı protein 1 (53BP1)3 gibi çeşitli onarım faktörlerinin işe alınmasına izin verir. Daha sonra,DSB’leri 4,5’i onarmak için homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya tek iplikli tavlama (SSA) arasında bir yol tetiklenir. Bu nedenle, 53BP1, İK veya NHEJ arasındaki seçimi dikte etmede, esas olarak HR6 yerine NHEJ’nin aktivasyonunu teşvik etmede rol oynar. Dahası, hem H2AX histonun hem de 53BP1’in fosforile edilmiş formu, DSB’lerin bölgelerinde odaklar oluşturabilir. Bu odaklar, çift ipliğin bütünlüğü geri kazanılana kadar devam ettiğinden, γH2AX veya 53BP1 odaklarının bir zaman aralığında ortaya çıkışını / kaybolmasını değerlendirmek, bir hücre sisteminde DSB’lerin oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için yararlı bir yöntem olarak kabul edilir 6,7. Bununla birlikte, yukarıda tarif edilen moleküler süreçlere göre, γH2AX ve 53BP1 odaklarının DDR8,9 sırasında DSB’lerin yakınında birlikte lokalize olması beklendiğinden, bu belirteçlerin varlığını çift immünofloresanda eşzamanlı olarak tespit etmek yararlı olabilir.
Bu nedenle, bu makalenin amacı, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Aynı metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB’lerin onarım kinetiğini daha önce kurulmuş deneysel bir prosedür10’a göre tanımlamaya çalıştık.
Protocol
Representative Results
Discussion
γH2AX ve 53BP1 odaklarının immünofloresan analizi, bir hücre sisteminin fazlar arası çekirdeklerinde genomik hasarı değerlendirmek için uygun bir yöntemdir. Bu prosedür, deneylerin sonucunu, özellikle fiksasyon ve geçirgenlikte kullanılan ajanları, antikorların tipini ve seyreltme faktörlerini ve mutajenin konsantrasyonunu etkileyebilecek birkaç kritik noktaya sahiptir.
İmmünofloresan yöntemi, esas olarak protein olan antijenleri tanımlamayı beklediği için protein bü…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tam kan bağışçılarına ve kan örneklerini alan tüm sağlık personeline teşekkür ederiz.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
Riferimenti
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. . Fluorescence microscopy. 10, (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks – are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
