التألق المناعي المزدوج ل γH2AX و 53BP1 في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة لتقييم تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة من خلال الكشف المتزامن عن بؤر γH2AX و 53BP1 في نوى الطور البيني للخلايا الليمفاوية الطرفية البشرية المعالجة بالبليوميسين.
Abstract
تعد فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) واحدة من أشد الآفات التي يمكن أن تحدث في نوى الخلية ، وإذا لم يتم إصلاحها ، فقد تؤدي إلى نتائج خطيرة ، بما في ذلك السرطان. لذلك ، يتم تزويد الخلية بآليات معقدة لإصلاح DSBs ، وتتضمن هذه المسارات هيستون H2AX في شكله المفسفر في Ser-139 (أي γH2AX) وبروتين ربط p53 1 (53BP1). نظرا لأن كلا البروتينين يمكن أن يشكلان بؤرا في مواقع DSBs ، فإن تحديد هذه العلامات يعتبر طريقة مناسبة لدراسة كل من DSBs وحركية إصلاحها. وفقا للعمليات الجزيئية التي تؤدي إلى تكوين بؤر γH2AX و 53BP1 ، قد يكون من المفيد أكثر التحقيق في توطينها المشترك بالقرب من DSBs من أجل إعداد نهج بديل يسمح بقياس DSBs عن طريق الكشف المتزامن عن علامتين لتلف الحمض النووي. وبالتالي ، يهدف هذا البروتوكول إلى تقييم الضرر الجينومي الناجم في الخلايا الليمفاوية البشرية بواسطة عامل المحاكاة الإشعاعية بليوميسين من خلال وجود بؤر γH2AX و 53BP1 في تألق مناعي مزدوج. باستخدام هذه المنهجية ، حددنا أيضا التباين في عدد بؤر γH2AX و 53BP1 بمرور الوقت ، كمحاولة أولية لدراسة حركية الإصلاح ل DSBs التي يسببها بليوميسين.
Introduction
يحدث تلف الحمض النووي باستمرار بواسطة عوامل يمكن أن تكون داخلية المنشأ ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن التمثيل الغذائي التأكسدي الخلوي ، أو الخارجية ، سواء المواد الكيميائية أو الفيزيائية1. من بين الآفات الأكثر ضررا ، تلعب فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) دورا أساسيا في المساهمة في عدم الاستقرار الجيني ، لأنها تسبب انحرافات الكروموسومات التي بدورها يمكن أن تبدأ عملية التسرطن. وبالتالي ، يتم تزويد الخلايا بآليات معقدة وفعالة لإصلاح DSBs2.
عندما يحدث DSB ، تقوم الخلية بتشغيل استجابة تلف الحمض النووي (DDR) حيث ، جنبا إلى جنب مع مركب MRE11 / RAD50 / NBS1 ، يتم تجنيد كينازات ATM أو ATR لتنشيط البروتينات الأخرى التي تبطئ أو توقف دورة الخلية3. الهدف الأساسي لهذه الكينازات هو هيستون H2AX ، الذي يتم فسفرته على Ser-139 ضمن عدد قليل من القواعد الضخمة من DSBs (أي γH2AX) ، مما يسمح بتوظيف العديد من عوامل الإصلاح مثل ، من بين أمور أخرى ، BRCA1 و p53 بروتين الربط 1 (53BP1) 3. في وقت لاحق ، يتم تشغيل مسار واحد بين إعادة التركيب المتماثل (HR) ، أو الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، أو التلدين أحادي الشريط (SSA) لإصلاح DSBs 4,5. لذلك ، تشارك 53BP1 في إملاء الاختيار بين HR أو NHEJ ، مما يعزز بشكل أساسي تنشيط NHEJ بدلا من HR6. علاوة على ذلك ، يمكن أن يشكل كل من الشكل المفسفر لهستون H2AX و 53BP1 بؤرا في مواقع DSBs. مع استمرار هذه البؤر حتى يتم استعادة سلامة الشريط المزدوج ، يعتبر تقييم مظهر / اختفاء بؤر γH2AX أو 53BP1 خلال فترة زمنية طريقة مفيدة لتقييم حدوث وإصلاح DSBs في نظام الخلية 6,7. ومع ذلك ، وفقا للعمليات الجزيئية الموصوفة أعلاه ، نظرا لأنه من المتوقع أن تتركز بؤر γH2AX و 53BP1 بالقرب من DSBs خلال DDR 8,9 ، فقد يكون من المفيد الكشف بشكل متزامن عن وجود هذه العلامات في تألق مناعي مزدوج.
وبالتالي ، كان الهدف من هذه المخطوطة هو تقييم مدى ملاءمة القياس الكمي المتزامن لبؤر γH2AX و 53BP1 لتقييم الضرر الجيني الناجم في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية بواسطة عامل المحاكاة الإشعاعية بليوميسين. باستخدام نفس المنهجية ، حاولنا أيضا تحديد حركية الإصلاح ل DSBs التي يسببها بليوميسين وفقا لإجراء تجريبي تم إعداده مسبقا10.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد تحليل التألق المناعي لبؤر γH2AX و 53BP1 طريقة مناسبة لتقييم الضرر الجيني في نوى الطور البيني لنظام الخلية. يحتوي هذا الإجراء على العديد من النقاط الحرجة التي يمكن أن تؤثر على نتائج التجارب ، بشكل أساسي ، العوامل المستخدمة في التثبيت والنفاذية ، ونوع الأجسام المضادة وعوامل تخفيفها ، وتركيز…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للمتبرعين بالدم بالكامل ولجميع العاملين الصحيين الذين أخذوا عينات الدم.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
Riferimenti
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. . Fluorescence microscopy. 10, (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks – are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
