Duale Immunfluoreszenz von γH2AX und 53BP1 in humanen peripheren Lymphozyten
Summary
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch den gleichzeitigen Nachweis von γH2AX- und 53BP1-Foci in Interphasenkernen von Bleomycin-behandelten humanen peripheren Lymphozyten dar.
Abstract
Doppelstrangbrüche (DSBs) sind eine der schwersten Läsionen, die in Zellkernen auftreten können, und wenn sie nicht repariert werden, können sie zu schweren Folgen, einschließlich Krebs, führen. Die Zelle ist daher mit komplexen Mechanismen zur Reparatur von DSBs ausgestattet, und diese Signalwege beinhalten Histon H2AX in seiner phosphorylierten Form an Ser-139 (nämlich γH2AX) und das p53-bindende Protein 1 (53BP1). Da beide Proteine an den Stellen von DSBs Herde bilden können, wird die Identifizierung dieser Marker als geeignete Methode angesehen, um beide DSBs und ihre Reparaturkinetik zu untersuchen. Entsprechend den molekularen Prozessen, die zur Bildung von γH2AX- und 53BP1-Foci führen, könnte es sinnvoller sein, ihre Kolokalisation in der Nähe der DSBs zu untersuchen, um einen alternativen Ansatz zu etablieren, der die Quantifizierung von DSBs durch die gleichzeitige Detektion von zwei DNA-Schadensmarkern ermöglicht. Daher zielt dieses Protokoll darauf ab, die genomische Schädigung in humanen Lymphozyten durch den radiomimetischen Wirkstoff Bleomycin durch die Anwesenheit von γH2AX- und 53BP1-Foci in einer dualen Immunfluoreszenz zu untersuchen. Mit dieser Methodik haben wir auch die Variation in der Anzahl der γH2AX- und 53BP1-Foci im Laufe der Zeit beschrieben, als vorläufigen Versuch, die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs zu untersuchen.
Introduction
DNA-Schäden werden kontinuierlich durch Substanzen induziert, die endogen sein können, wie z. B. ROS, die durch den zellulären oxidativen Stoffwechsel erzeugt werden, oder durch exogene, sowohl chemische als auch physikalische Stoffe1. Zu den schädlichsten Läsionen gehören Doppelstrangbrüche (DSBs), die eine grundlegende Rolle bei der genomischen Instabilität spielen, da sie Chromosomenaberrationen verursachen, die wiederum den Prozess der Krebsentstehung in Gang setzen können. Auf diese Weise werden Zellen mit komplexen und effizienten Mechanismen der Reparatur von DSBs ausgestattet2.
Wenn ein DSB auftritt, löst die Zelle die DNA-Schadensantwort (DDR) aus, bei der zusammen mit dem MRE11/RAD50/NBS1-Komplex ATM- oder ATR-Kinasen rekrutiert werden, um andere Proteine zu aktivieren, die den Zellzyklus verlangsamen oder stoppen3. Ein wesentliches Ziel dieser Kinasen ist das Histon H2AX, das auf Ser-139 innerhalb weniger Megabasen aus den DSBs phosphoryliert ist (nämlich γH2AX), wodurch die Rekrutierung verschiedener Reparaturfaktoren wie u.a. BRCA1 und p53-bindendes Protein 1 (53BP1)3 ermöglicht wird. Später wird ein Weg zwischen homologer Rekombination (HR), nicht-homologem Endverknüpfen (NHEJ) oder Single-Strang-Annealing (SSA) ausgelöst, um die DSBs zu reparieren 4,5. Daher ist 53BP1 an der Wahl zwischen HR und NHEJ beteiligt und fördert hauptsächlich die Aktivierung von NHEJ anstelle von HR6. Darüber hinaus können sowohl die phosphorylierte Form des H2AX-Histons als auch von 53BP1 Foci an den Stellen von DSBs bilden. Da diese Foci so lange bestehen bleiben, bis die Integrität des Doppelstrangs wiederhergestellt ist, wird die Beurteilung des Auftretens/Verschwindens von γH2AX- oder 53BP1-Foci innerhalb eines Zeitintervalls als nützliche Methode angesehen, um das Auftreten und die Reparatur von DSBs in einem Zellsystem zu beurteilen 6,7. Da jedoch nach den oben beschriebenen molekularen Prozessen davon auszugehen ist, dass γH2AX- und 53BP1-Foci während DDR 8,9 in der Nähe der DSBs kolokalisiert werden, kann es sinnvoll sein, gleichzeitig das Vorhandensein dieser Marker in einer dualen Immunfluoreszenz nachzuweisen.
Ziel dieses Manuskripts war es daher, die Eignung der simultanen Quantifizierung von γH2AX- und 53BP1-Foci zu evaluieren, um die genomische Schädigung zu untersuchen, die in humanen peripheren Lymphozyten durch den radiomimetischen Wirkstoff Bleomycin induziert wird. Mit der gleichen Methodik versuchten wir auch, die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs gemäß einem zuvor aufgebauten experimentellen Verfahren10 zu beschreiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Immunfluoreszenzanalyse von γH2AX- und 53BP1-Foci ist eine geeignete Methode zur Beurteilung genomischer Schäden in Interphasenkernen eines Zellsystems. Dieses Verfahren weist mehrere kritische Punkte auf, die das Ergebnis der Experimente beeinflussen können, vor allem die bei der Fixierung und Permeabilisierung verwendeten Wirkstoffe, die Art der Antikörper und ihre Verdünnungsfaktoren sowie die Konzentration des Mutagens.
Die Aufrechterhaltung der Proteinintegrität ist von grundleg…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Vollblutspendern und dem gesamten Gesundheitspersonal, das die Blutproben entnommen hat.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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