Doppia immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei linfociti periferici umani
Summary
Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la rilevazione simultanea di focolai di γH2AX e 53BP1 nei nuclei interfase dei linfociti periferici umani trattati con bleomicina.
Abstract
Le rotture del doppio filamento (DSB) sono una delle lesioni più gravi che possono verificarsi nei nuclei cellulari e, se non riparate, possono portare a esiti gravi, incluso il cancro. La cellula è quindi dotata di meccanismi complessi per riparare le DSB, e queste vie coinvolgono l’istone H2AX nella sua forma fosforilata a Ser-139 (cioè γH2AX) e p53 binding protein 1 (53BP1). Poiché entrambe le proteine possono formare focolai nei siti delle DSB, l’identificazione di questi marcatori è considerata un metodo adatto per studiare sia le DSB che la loro cinetica di riparazione. Secondo i processi molecolari che portano alla formazione di focolai di γH2AX e 53BP1, potrebbe essere più utile indagare la loro co-localizzazione vicino alle DSB al fine di impostare un approccio alternativo che consenta di quantificare le DSB mediante la rilevazione simultanea di due marcatori di danno al DNA. Pertanto, questo protocollo mira a valutare il danno genomico indotto nei linfociti umani dall’agente radiomimetico bleomicina attraverso la presenza di focolai di γH2AX e 53BP1 in una doppia immunofluorescenza. Utilizzando questa metodologia, abbiamo anche delineato la variazione del numero di focolai di γH2AX e 53BP1 nel tempo, come tentativo preliminare di studiare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina.
Introduction
Il danno al DNA è continuamente indotto da agenti che possono essere endogeni, come i ROS generati dal metabolismo ossidativo cellulare, o esogeni, sia chimici che fisici1. Tra le lesioni più dannose, le rotture a doppio filamento (DSB) svolgono un ruolo fondamentale nel contribuire all’instabilità genomica, poiché causano aberrazioni cromosomiche che a loro volta possono avviare il processo di carcinogenesi. Pertanto, le cellule sono dotate di meccanismi complessi ed efficienti di riparazione dei DSB2.
Quando si verifica un DSB, la cellula innesca la risposta al danno del DNA (DDR) dove, insieme al complesso MRE11 / RAD50 / NBS1, vengono reclutate chinasi ATM o ATR per attivare altre proteine che rallentano o fermano il ciclo cellulare3. Un bersaglio essenziale di queste chinasi è l’istone H2AX, che è fosforilato su Ser-139 entro poche megabasi dai DSB (vale a dire γH2AX), consentendo così il reclutamento di diversi fattori di riparazione come, tra gli altri, BRCA1 e p53 binding protein 1 (53BP1)3. Successivamente, viene attivato un percorso tra ricombinazione omologa (HR), giunzione finale non omologa (NHEJ) o ricottura a singolo filamento (SSA) per riparare i DSB 4,5. Pertanto, 53BP1 è coinvolto nel dettare la scelta tra HR o NHEJ, promuovendo principalmente l’attivazione di NHEJ piuttosto che HR6. Inoltre, sia la forma fosforilata dell’istone H2AX che il 53BP1 possono formare focolai nei siti delle DSB. Poiché questi focolai persistono fino a quando non viene ripristinata l’integrità del doppio filamento, valutare l’aspetto/scomparsa dei focolai di γH2AX o 53BP1 entro un intervallo di tempo è considerato un metodo utile per valutare l’insorgenza e la riparazione di DSB in un sistema cellulare 6,7. Tuttavia, secondo i processi molecolari sopra descritti, poiché ci si aspetta che γH2AX e 53BP1 si co-localizzino vicino ai DSB durante DDR8,9, può essere utile rilevare contemporaneamente la presenza di questi marcatori in una doppia immunofluorescenza.
Pertanto, lo scopo di questo manoscritto era quello di valutare l’idoneità della quantificazione simultanea dei focolai di γH2AX e 53BP1 per valutare il danno genomico indotto nei linfociti periferici umani dall’agente radiomimetico bleomicina. Utilizzando la stessa metodologia, abbiamo anche tentato di delineare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina secondo una procedura sperimentale precedentemente impostata10.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi di immunofluorescenza dei focolai di γH2AX e 53BP1 è un metodo adatto per valutare il danno genomico nei nuclei interfase di un sistema cellulare. Questa procedura presenta diversi punti critici che possono influenzare l’esito degli esperimenti, principalmente gli agenti utilizzati nella fissazione e permeabilizzazione, il tipo di anticorpi e i loro fattori di diluizione e la concentrazione del mutageno.
Il mantenimento dell’integrità proteica è fondamentale poiché il metodo del…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a tutti i donatori di sangue e a tutto il personale sanitario che ha prelevato i campioni di sangue.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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