Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos
Summary
Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.
Abstract
As quebras de fita dupla (DSBs) são uma das lesões mais graves que podem ocorrer nos núcleos celulares e, se não reparadas, podem levar a desfechos graves, incluindo câncer. A célula é, portanto, provida de mecanismos complexos para reparar DSBs, e essas vias envolvem histona H2AX em sua forma fosforilada em Ser-139 (ou seja, γH2AX) e proteína ligadora de p53 1 (53BP1). Como ambas as proteínas podem formar focos nos sítios dos DSBs, a identificação desses marcadores é considerada um método adequado para estudar tanto os DSBs quanto sua cinética de reparo. De acordo com os processos moleculares que levam à formação dos focos γH2AX e 53BP1, poderia ser mais útil investigar sua co-localização perto dos DSBs, a fim de estabelecer uma abordagem alternativa que permita quantificar os DSBs pela detecção simultânea de dois marcadores de dano ao DNA. Assim, este protocolo tem como objetivo avaliar o dano genômico induzido em linfócitos humanos pelo agente radiomimético bleomicina através da presença de focos γH2AX e 53BP1 em imunofluorescência dupla. Usando essa metodologia, também delineamos a variação no número de focos γH2AX e 53BP1 ao longo do tempo, como uma tentativa preliminar de estudar a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina.
Introduction
O dano ao DNA é continuamente induzido por agentes que podem ser endógenos, como as EROs geradas pelo metabolismo oxidativo celular, ou exógenos, tanto químicos quanto físicos1. Dentre as lesões mais lesivas, as quebras de dupla fita (DSBs) têm papel fundamental na contribuição para a instabilidade genômica, uma vez que causam aberrações cromossômicas que, por sua vez, podem iniciar o processo de carcinogênese. Assim, as células são providas de mecanismos complexos e eficientes de reparo deDSBs 2.
Quando ocorre um DSB, a célula desencadeia a resposta de dano ao DNA (DDR) onde, juntamente com o complexo MRE11/RAD50/NBS1, as quinases ATM ou ATR são recrutadas para ativar outras proteínas que retardam ou interrompem o ciclo celular3. Um alvo essencial dessas quinases é a histona H2AX, que é fosforilada em Ser-139 dentro de algumas megabases dos DSBs (ou seja, γH2AX), permitindo assim o recrutamento de vários fatores de reparo, tais como, entre outros, BRCA1 e proteína ligadora de p53 1 (53BP1)3. Posteriormente, uma via entre recombinação homóloga (HR), junção final não homóloga (NHEJ) ou recozimento de fita simples (SSA) é acionada para reparar os DSBs 4,5. Portanto, o 53BP1 está envolvido em ditar a escolha entre FC ou EJNH, promovendo principalmente a ativação do NHEJ ao invés da FC6. Além disso, tanto a forma fosforilada da histona H2AX quanto a 53BP1 podem formar focos nos sítios dos DSBs. Como esses focos persistem até que a integridade da dupla fita seja restaurada, avaliar o aparecimento/desaparecimento dos focos γH2AX ou 53BP1 em um intervalo de tempo é considerado um método útil para avaliar a ocorrência e o reparo de DSBs em um sistema celular 6,7. No entanto, de acordo com os processos moleculares descritos acima, uma vez que se espera que os focos de γH2AX e 53BP1 co-localizem próximos aos DSBs durante aDDR8,9, pode ser útil detectar concomitantemente a presença desses marcadores em uma imunofluorescência dupla.
Assim, o objetivo deste artigo foi avaliar a adequação da quantificação simultânea dos focos γH2AX e 53BP1 para avaliar o dano genômico induzido em linfócitos periféricos humanos pelo agente radiomimético bleomicina. Usando a mesma metodologia, também tentamos delinear a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina de acordo com um procedimento experimental previamente estabelecido10.
Protocol
Representative Results
Discussion
A análise por imunofluorescência dos focos γH2AX e 53BP1 é um método adequado para avaliar danos genômicos em núcleos interfásicos de um sistema celular. Esse procedimento possui vários pontos críticos que podem afetar o resultado dos experimentos, principalmente, os agentes utilizados na fixação e permeabilização, o tipo de anticorpos e seus fatores de diluição, e a concentração do mutagênico.
A manutenção da integridade proteica é fundamental, uma vez que o método de i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos aos doadores de sangue total e a todo o pessoal de saúde que colheu as amostras de sangue.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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