ヒト末梢リンパ球におけるγH2AXと53BP1の二重免疫蛍光法
Summary
このプロトコルは、ブレオマイシン処理されたヒト末梢リンパ球の間期核におけるγH2AXおよび53BP1病巣の同時検出を通じて、DNA二本鎖切断の形成および修復を評価する方法を提示する。
Abstract
二本鎖切断(DSB)は、細胞核に発生する可能性のある最も重篤な病変の1つであり、修復されない場合、癌を含む重篤な結果につながる可能性があります。したがって、細胞はDSBを修復するための複雑なメカニズムを備えており、これらの経路には、Ser-139(すなわちγH2AX)およびp53結合タンパク質1(53BP1)のリン酸化形態のヒストンH2AXが含まれます。両方のタンパク質はDSBの部位で病巣を形成する可能性があるため、これらのマーカーの同定は、DSBとその修復速度論の両方を研究するのに適した方法と考えられています。γH2AXと53BP1病巣の形成につながる分子プロセスによると、2つのDNA損傷マーカーを同時に検出することによってDSBを定量できる代替アプローチを設定するために、DSB付近でのそれらの共局在を調べることがより有用である可能性があります。したがって、このプロトコルは、二重免疫蛍光におけるγH2AXおよび53BP1病巣の存在を介して、放射線模倣剤ブレオマイシンによってヒトリンパ球に誘導されるゲノム損傷を評価することを目的としています。この方法論を用いて、ブレオマイシン誘発性DSBの修復動態を研究する予備的な試みとして、γH2AXと53BP1病巣の数の経時的な変化も明らかにしました。
Introduction
DNA損傷は、細胞の酸化的代謝によって生成されるROSなどの内因性、または化学物質と物理的の両方の外因性の薬剤によって継続的に誘発されます1。最も有害な病変の中で、二本鎖切断(DSB)は、染色体異常を引き起こし、それが発がんプロセスを開始する可能性があるため、ゲノム不安定性に寄与する上で基本的な役割を果たします。したがって、細胞はDSBを修復する複雑で効率的なメカニズムを備えている2。
DSBが発生すると、細胞はDNA損傷応答(DDR)をトリガーし、MRE11 / RAD50 / NBS1複合体とともに、ATMまたはATRキナーゼが動員され、細胞周期を遅くしたり停止したりする他のタンパク質を活性化します3。これらのキナーゼの必須標的はヒストンH2AXであり、これはDSBから数メガ塩基以内のSer-139上でリン酸化され(すなわちγH2AX)、それによってBRCA1およびp53結合タンパク質1(53BP1)3などのいくつかの修復因子の動員を可能にする。その後、相同組換え(HR)、非相同末端結合(NHEJ)、または一本鎖アニーリング(SSA)の間の1つの経路がトリガーされ、DSBが修復されます4,5。したがって、53BP1はHRまたはNHEJの選択を決定することに関与し、主にHR6ではなくNHEJの活性化を促進します。さらに、H2AXヒストンのリン酸化型と53BP1の両方がDSBの部位に病巣を形成する可能性があります。これらの病巣は二本鎖の完全性が回復するまで持続するため、時間間隔内のγH2AXまたは53BP1病巣の出現/消失を評価することは、細胞系におけるDSBの発生および修復を評価するための有用な方法と考えられる6,7。しかし、上記の分子プロセスによれば、γH2AXと53BP1病巣はDDR 8,9の間にDSBの近くで共局在することが予想されるので、二重免疫蛍光においてこれらのマーカーの存在を同時に検出することは有用であり得る。
したがって、この原稿の目的は、放射性模倣剤ブレオマイシンによってヒト末梢リンパ球に誘発されるゲノム損傷を評価するためのγH2AXと53BP1病巣の同時定量の適合性を評価することでした。同じ方法論を使用して、以前に設定された実験手順10に従って、ブレオマイシン誘発性DSBの修復速度論を描写することも試みました。
Protocol
Representative Results
Discussion
γH2AXおよび53BP1病巣の免疫蛍光分析は、細胞系の間期核におけるゲノム損傷を評価するのに適した方法です。この手順には、実験の結果に影響を与える可能性のあるいくつかの重要なポイント、主に固定および透過処理に使用される薬剤、抗体の種類とその希釈因子、および変異原の濃度があります。
免疫蛍光法は、主にタンパク質である抗原を同定することが期待され…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
全血献血者と血液サンプルを採取したすべての医療従事者に感謝します。
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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