Описано, как создать широко используемую хирургическую модель ишемически-реперфузионного повреждения кишечника (ИРИ) у грызунов. Процедура предполагает окклюзию верхней брыжеечной артерии с последующим восстановлением кровотока. Эта модель полезна для исследований, изучающих окклюзионные причины кишечного ИРИ как в ветеринарии, так и в медицине человека.
Ишемически-реперфузионное повреждение кишечника (ИРИ) связано с множеством состояний как в ветеринарии, так и в медицине человека. Кишечные заболевания ИРИ, такие как заворот желудка (ГРВ), заворот брыжейки и колики, наблюдаются у таких животных, как собаки и лошади. Первоначальное прерывание кровотока приводит к ишемизации тканей. Несмотря на то, что это необходимо для спасения жизнеспособной ткани, последующая реперфузия может вызвать дальнейшее повреждение. Основным механизмом, ответственным за ИРИ, является образование свободных радикалов при реперфузии и повторном введении кислорода в поврежденную ткань, но в этом участвует много других компонентов. Возникающие в результате местные и системные эффекты часто дают неблагоприятный прогноз.
Кишечная ИРИ является предметом обширных исследований в течение последних 50 лет. Модель грызуна in vivo , в которой основание верхней брыжеечной артерии (СМА) временно перевязывается, в настоящее время является наиболее распространенным методом, используемым для изучения кишечного ИРИ. В данной работе мы описываем модель кишечного ИРИ с использованием изофлурановой анестезии в медицинском воздухе с содержанием 21%O2 , что приводит к воспроизводимому повреждению, что подтверждается последовательной гистопатологией тонкой кишки. Также оценивали повреждение тканей толстой кишки, печени и почек.
Ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ) может возникнуть в любом органе и включает в себя два последовательных компонента. Первоначальное прекращение кровотока приводит к ишемизации пораженных тканей, а затем последующая реперфузия вызывает дальнейшее повреждение клеток. Ущерб от реперфузии часто превышает ущерб, вызванный ишемией1. Патофизиология ИРИ включает в себя сложный каскад событий, наиболее заметным из которых является образование свободных радикалов при повторном введении кислорода, которое происходит во время реперфузии2. Активация воспалительных клеток и цитокинов также играет роль2. В случаях кишечного ИРИ бактериальная транслокация в кровоток после повреждения эндотелия может привести к синдрому системной воспалительной реакции2. Если повреждение, вызванное ИРИ, достаточно серьезное, возникающие в результате системные эффекты могут привести к полиорганной недостаточности3.
Случаи кишечного ИРИ ассоциированы с высокой заболеваемостью и смертностью 4,5,6. ИРИ кишечника связана со многими патологическими состояниями и хирургическими процедурами как в ветеринарии, так и в медицине человека. В ветеринарии животные особенно склонны к кишечным заболеваниям ИРИ, таким как заворот желудка (ГРВ), заворот брыжейки и колики 7,8. У людей ИРИ является основной и часто встречающейся проблемой при хирургии аневризмы брюшной аорты, ущемленных грыжах, острой мезентериальной ишемии, завороте, травме, шоке, неонатальном некротизирующем энтероколите и резекции или трансплантации тонкой кишки9.
Большинство исследований кишечного ИРИ in vivo на грызунах включают окклюзию основания верхней брыжеечной артерии (СМА), ветви брюшной аорты, которая снабжает кровью большую часть тонкой кишки и проксимальную часть толстой кишки 10,11,12. Несмотря на широкое применение этой модели и относительную простоту, подробный протокол с использованием ингаляционной анестезии в медицинском воздухе 21%O2 не опубликован. Отсутствие стандартного протокола создает трудности для исследователей, которые не знакомы с процедурой, и препятствует согласованности между исследованиями. Мы демонстрируем шаги, необходимые для проведения хирургической модели кишечной ИРИ у 8-14-недельных самцов и самок швейцарских мышей породы Webster. Эта модель кишечного ИРИ приводит к воспроизводимому повреждению, что подтверждается последовательной гистопатологией.
Несмотря на широкое распространение этой модели кишечного ИРИ, она не лишена своих ограничений. Например, единственная окклюзия только основания СМА не полностью препятствует притоку крови к кишечнику. Вероятно, это связано с обширной коллатеральной циркуляцией в брыжейке, которая может забирать кровь из соседних ветвей брюшной аорты. В одном исследовании у кошек окклюзия СМА снижала кровоток на 35% в проксимальном отделе двенадцатиперстной кишки, на 61% в дистальном отделе двенадцатиперстной кишки, на 71% в тощей и подвздошной кишках и на 63% в проксимальном отделе толстой кишки. Кровоток не был снижен в средней и дистальной ободочной кишке, которые получают большую часть своего кровообращения из нижней брыжеечной артерии23. У грызунов тощая и подвздошная кишки чаще всего упоминаются в качестве сегментов кишечника, которые подвергаются наиболее значительному повреждению тканей после окклюзии СМА9.
В литературе приводится широкий диапазон времени ишемии после окклюзии СМА, от 1 до 90 мин и более. Разное время ишемии приводит к разным уровням реперфузионного повреждения; Park et al. наблюдали реперфузионное повреждение, когда ишемический интервал составлял от 40 до 60 минут, но не тогда, когда ишемический интервал был короче или длиннее24. Такие результаты свидетельствуют о том, что более короткие промежутки времени не вызывают достаточной ишемии, чтобы спровоцировать реперфузионное повреждение, в то время как более длительные промежутки времени повреждают ткань настолько сильно, что невозможно продемонстрировать последующее реперфузионное повреждение. Кроме того, более длительное время ишемии сопряжено с риском повышенной смертности. Как видно из нашего исследования, 50% (3/6) первоначальных мышей, подвергшихся 60-минутной ишемии, умерли уже после 90-минутной реперфузии. Сокращение времени ишемии до 45 мин снизило смертность до 20% (1/5) без изменения показателей повреждения тканей. Основываясь на нашем исследовании, представляется, что идеальное окно ишемического повреждения может быть достигнуто окклюзией СМА в течение примерно 45 минут.
Другой переменной является время реперфузии до забора ткани. Как и в случае с периодами ишемии, время реперфузии сильно варьируется в зависимости от исследования, от 60 мин до более 24 ч. В нескольких работах сообщалось, что слизистая оболочка кишечника подвергается максимальному морфологическому повреждению через 2-3 ч после реперфузии, а полное восстановление достигается через 24 ч 25,26,27. Забор тканей до этого 2-3-часового окна рискует не охватить всю степень реперфузионного повреждения, в то время как ткани, собранные ближе к 24 часам, уже начнут процесс восстановления. Первоначально мы выбрали время реперфузии 120 минут, но затем перешли на 90 минут, чтобы снизить смертность. Это изменение не повлияло на результаты повреждения тканей, что позволяет предположить, что 30-минутное отклонение от 2-3-часового окна является приемлемым.
Концентрация кислорода также является важной переменной в развитии IRI. Уайлдинг и др. обнаружили, что по сравнению с мышами, получавшими 21%О2, у мышей, получавших анестезию с изофлураном со 100%О2 , наблюдалось несоответствие вентиляции и перфузии из-за ателектаза. В том же исследовании у крыс, получавших 100%О2 , развился острый респираторный ацидоз и повышенное среднее артериальное давление28. Таких физиологических изменений лучше избегать при индуцировании такой травмы, как ИРИ, в которой участвует ряд системных факторов. Таким образом, 21%О2 представляется более подходящим, чем 100%О2 , в качестве газа-носителя для доставки изофлурана.
Использование гепарина в этом протоколе открыто для обсуждения. Известно, что гепарин обладает антикоагуляционным и противовоспалительным действием29. Мы обнаружили, что переход от 60-минутной ишемии и 120-минутной реперфузии к 45-минутной ишемии и 90-минутной реперфузии с гепарином 400 МЕ/кг не изменил микроскопического повреждения кишечника, но снизил смертность. Одно из возможных объяснений заключается в том, что гепарин предотвращал смертельную тромбоэмболию отдаленных органов, таких как легкие и мозг, однако мы не нашли доказательств этого при вскрытии при грубом или микроскопическом исследовании первых двух мышей, которые умерли. Использование более короткого времени ишемии и реперфузии без гепарина может быть столь же эффективным для снижения смертности. Если бы это было так, было бы разумно отказаться от использования гепарина, чтобы свести к минимуму вмешательство в ИРИ. Тем не менее, включение гепарина в протокол может быть целесообразным для тех, кто хочет смоделировать хирургические причины ИРИ, поскольку хирургические пациенты часто получают гепарин периоперационно.
Было показано, что изофлуран оказывает тканезащитное действие в случаях воспаления и ишемии кишечника, и его применение может мешать клинически значимой модели IRI 30,31,32. Тем не менее, фторорганические ингалянты (т.е. изофлуран, севофлуран) являются широко используемыми анестетиками как в ветеринарии, так и в медицине человека. Кроме того, продолжительность анестезии, необходимая для этого протокола, превышает 120 минут, и, таким образом, ингалянт более подходящий, чем инъекционный препарат более короткого действия, который необходимо повторно дозировать.
Микроскопических поражений в проксимальном отделе толстой кишки, печени или почках не было. Отсутствие микроскопических изменений, возможно, было связано с относительно коротким временем реперфузии от 90 до 120 минут. Кроме того, проксимальный отдел толстой кишки имеет кровоснабжение из нижней брыжеечной артерии. Однако отсутствие видимых повреждений не исключает системной травмы. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР), вероятно, является лучшей методологией для демонстрации системного повреждения путем измерения воспалительных цитокинов, таких как TNF-α.
На протяжении многих лет было разработано несколько вариаций этой модели кишечного ИРИ. В 1990 г. Megison et al. продемонстрировали, что окклюзия коллатеральных сосудов в дополнение к СМА приводит к более последовательному снижению брыжеечного кровотока, ноувеличению смертности. Более позднее исследование показало, что вместо окклюзии СМА в ее основании, перевязка ее периферических и коллатеральных ветвей для индуцирования ишемии в дистальном отделе подвздошной кишки приводила к воспроизводимому повреждениюбез летального исхода. Окклюзия локальных артериальных ветвей обеспечивает максимальную ишемию и может решить проблему мультифокального, сегментарного снижения кровотока, наблюдаемого при перевязке СМА только в ее основании. В то время как этот альтернативный метод моделирования кишечного ИРИ имеет применение для исследования местных тканевых эффектов кишечного ИРИ, неизвестно, может ли он точно смоделировать системное воспаление и полиорганную недостаточность, которые могут быть связаны с повреждением кишечника.
Окклюзия СМА не является подходящей моделью для всех типов кишечного ИРИ. Неокклюзионная мезентериальная ишемия, например, характеризуется спланхнической гипоперфузией, обусловленной снижением сердечного выброса. Таким образом, этот метод не является оптимальным для изучения кишечного ИРИ, вызванного инфарктом миокарда, застойной сердечной недостаточностью, аортальной недостаточностью, заболеваниями почек или печени35. Kozar et al. сообщили, что окклюзия СМА, тем не менее, является клинически значимой моделью для кишечной ИРИ, индуцированной шоком36. Хотя это менее экономично, использование других видов, таких как свиньи, может иметь преимущества перед грызунами для моделирования определенных состояний кишечного повреждения. В комплексном обзоре, проведенном Gonzalez et al. в 2014 году, описаны животные модели, используемые в настоящее время для исследования кишечного IRI9.
Несмотря на свои ограничения, методика окклюзии СМА в ее основе остается одной из наиболее часто используемых моделей ишемии кишечника у грызунов9. Поскольку для этого требуется только один сосудистый зажим и базовая установка, сама операция довольно проста. Это также приводит к воспроизводимым повреждениям, о чем свидетельствуют представленные здесь данные. Окклюзия СМА у грызунов может надежно моделировать окклюзионные причины кишечного ИРИ и может иметь практическое применение как в ветеринарии, так и в медицине человека. В связи с этим важно, чтобы процедуры, которые мы здесь изложили, выполнялись последовательно.
The authors have nothing to disclose.
Финансирование этого проекта было предоставлено Отделом внутренних исследований Национального института сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения.
Мы хотели бы поблагодарить доктора Джеймса Хокинса за его наставничество и поддержку. Мы также благодарим докторов Михая Олтеана и Роберта Линфорда за помощь в определении местоположения верхней брыжеечной артерии. Мы хотели бы выразить нашу благодарность докторам Патрисии Карвальо Обейд Эллрих, Клаудио Корреа Наталини и Джорджу Хауэллу III за предоставленный опыт при разработке этого протокола. Наконец, мы хотели бы поблагодарить Стивена Винковича (Stephen Wincovitch) за его помощь в приобретении прекрасных микрофотографий, представленных в этой статье, и доктора Алисию Оливье (Alicia Olivier) за ее помощь в маркировке и отображении окончательных рисунков.
Adson forceps | Roboz | RS-5236 | Surgical instrument |
Alm retractor | Roboz | RS-6510 | Surgical instrument |
Anesthesia machine | Datex-Ohmeda | Aestiva 5 | |
Anesthesia: isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | Dose: 1-4%, INH |
Angiocath 20 g x 2 | Smiths Medical | 5057 | Flushing intestines with saline and formalin |
Atraumatic microvascular clip | Teleflex | 065100 | Surgical instrument |
Buffered formalin 10% | Fisher Scientific | 23-245684 | Tissue fixation |
Bupivicaine 0.25% | Hospira, Inc. | NDC 0409-1160-18 | Dose: up to 2 mg/kg drop-wise |
Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Dose: 1 mg/kg, SQ |
Chlorhexidine scrub 2% | Vet One | 510083 | Surgical site prep |
Circulating water blanket | Cincinnati Sub Zero | Blanketrol 2 | Body temp maintenance |
Clippers – Wahl BravMini, Purple Hair clippers | Lambert Vet Supply | 008WA-41590-0438 | Surgical site prep |
Conical tubes 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | Tissue fixation and storage |
Dry ice | N/A | N/A | PCR tissue samples |
EtOH 200 proof | The Warner-Graham Company | 64-17-5 | Tissue storage |
Heparin (optional) | Meitheal Pharmaceuticals | NDC 71288-402-11 | Dose: 200-600 IU/kg |
Induction chamber | VetEquip | 941456 | |
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor | Indus Instruments | N/A | For monitoring rodent body temperature during surgery |
Isopropyl Alcohol 70% | Humco | NDC 0395-4202-28 | For scrubbing surgical site |
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL | Fisher Scientific | 05-408-121 | PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage |
Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
Nose cone | N/A | N/A | Can be homemade with syringe tube or bubble tubing |
O2 medical air 21% | Roberts Oxygen | N/A | Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume |
Ophthalmic ointment | Akorn, Inc. | NDC 17478-062-35 | Surgical prep |
PBS pH 7.4 (1x) | ThermoFisher Scientific | 10010-031 | For tissue rinsing and making 70% EtOH |
Specimen cups | Cardinal Healthcare | C13005 | For holding tissue cassettes in formalin |
Sterile Castroviejo Needle Holder | Roboz | RS-6412 | Surgical instrument |
Sterile cotton swabs | Medline | BXTA50002Z | |
Sterile gauze | Medline | PRM21423Z | |
Sterile Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5980 | Surgical instrument |
Sterile micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5693 | Surgical instrument |
Sterile micro forceps | Roboz | RS-5264 | Surgical instrument |
Sterile saline (0.9%) | Braun | R5201-01 | Must be warmed |
Sterile scalpel blade #15 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-015 | Surgical instrument |
Sterile scalpel handle | Roboz | RS-9843 | Surgical instrument |
Sterile surgical drape | Medline | DYNJSD1092 | |
Sterile surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
Sterile surgical stapler | Roboz | RS-9260 | Surgical instrument |
Sterile surgical staples | Roboz | RS-9262 | Abdominal skin closure |
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle | Ethicon | J212G | Closing abdominal muscle |
Surgical tape | Medline | MMM15271Z | Securing mouse in dorsal recumbancy |
Syringe 10 ml x 2 | Medline | SYR110010 | Flushing intestines with saline and formalin |
Tissue cassettes | Fisher Scientific | 22-038-665 | Rolled intestinal segments. 4 per mouse. |
Towel or drape | Medline | GEM2140 | Water blanket cover |