肠系膜上动脉闭塞的肠缺血再灌注损伤的啮齿动物模型

此处描述的程序已获得美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所动物护理和使用委员会的批准，并符合《关于人道护理和使用实验动物的公共卫生服务政策》、《动物福利法》和《实验动物护理和使用指南》中概述的政策。 1. 手术设置 遵循无菌程序。戴上口罩、发套和干净的连身衣/实验室外套/手术磨砂膏。 准备以下消毒材料：手术器械（见 材料表）、生理盐水、棉签、纱布、手术钉、手术窗帘和手套。还要获得不需要消毒的手术胶带。使用高压灭菌器或环氧乙烷灭菌技术对材料进行灭菌。 在手术区域放置加热的循环水毯，并用无菌毛巾或窗帘盖住。 使用精密异氟醚汽化器、加压医用空气（21% O2）和带有专为小鼠设计的鼻锥的 Bain 非再呼吸回路以提供手术麻醉。 2.动物准备 通过以每升室容积0.5L / min的速率递送2%-4%异氟醚和21%O2 医用空气，在诱导室中麻醉小鼠。注意：对于此特定型号，最好使用 21% O2 医用空气而不是 100% O2 ，因为用 O2 饱和血液可能会干扰 IRI。 将鼠标从腔室中取出，并将其移动到与手术区域分开的干净表面上。将其与鼻锥配合使用，提供 1.5% 异氟烷和 21% O2 医用空气。 皮下注射 1 mg/kg 丁丙诺啡到颈胸背侧区域。 腹膜内注射200-600IU/kg肝素，以防止闭塞期间血栓形成。 将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止角膜损伤。 用剪刀去除腹腹的毛发。 将鼠标移动到手术区域的热水毯上。同样，将其与提供 1.5% 异氟醚和 21% O2 医用空气的鼻锥配合使用，以实现手术麻醉平面。 将鼠标置于背卧位置，并用手术胶带将四肢固定在桌子上。 使用啮齿动物专用温度计直肠监测动物的体温。在整个手术过程中将体温保持在36.5±0.5°C。 使用浸泡在洗必泰磨砂膏或聚维酮碘磨砂膏中的无菌纱布对腹腹腹部进行消毒，然后用 70% 酒精消毒。重复此序列三次，在磨砂膏和酒精之间交替进行。每次都应使用一套新的磨砂膏和酒精纱布。以圆周运动涂抹磨砂膏和酒精，从手术部位中心的小圆圈开始，通过增加圆圈的大小逐渐向边缘移动。到达手术部位边缘后丢弃纱布。不要从边缘向后擦洗到中心。 进行脚趾捏合测试（踏板反射）以确保动物完全麻醉。 戴上无菌手套。无菌覆盖手术部位。 3.手术和缺血 使用 #15 手术刀刀片在皮肤上做一个 3-5 厘米的腹侧中线腹部切口，将其从下面的肌肉筋膜中解剖出来，并横向反射。使用显微解剖剪刀或弹簧式微型剪刀继续切口，沿着白线穿过腹壁，并将牵开器放置到位。 将蘸有温热无菌盐水的无菌纱布垫放在手术区域周围。 从腹腔中取出小肠，将其翻转到颅内并向动物左侧移动，然后将其放在湿润的垫子上。将另一个湿润的纱布垫放在纸巾上以防止干燥。定期将温热的无菌盐水滴在纱布上，以保持组织湿润。 分离 SMA，它位于下腔静脉的腹侧、腹腔动脉的尾部和肾动脉的颅内。注意： 图 1 显示了 SMA 在手术过程中被隔离的位置。SMA通常位于下腔静脉的腹侧，并向右延伸。当肠道在手术过程中向外翻转并向左翻转时，SMA 位于下腔静脉的左侧。 在 SMA 底部放置一个无创伤微血管夹，使其从腹主动脉分支，确保夹子不会阻塞肠系膜上静脉。 通过注意颜色从粉红色到淡白色的变化以及肠系膜搏动的丧失来验证小肠缺血。 在缺血期间，将内脏恢复到腹腔内的原始位置。取下牵开器并用湿纱布覆盖切口。定期在纱布中加入温热的无菌生理盐水，以防止干燥并保持体温。 经过45分钟的缺血期（其开始以夹子的初始应用为标志），取下闭塞夹。通过观察肠系膜搏动和潮红颜色来验证血流的恢复。 在最终闭合之前腹膜内涂抹温热的无菌生理盐水，以保持适当的水合作用。 用 6-0 聚乳蛋白 910 缝合线闭合腹部肌肉。沿肌肉切口线给予布比卡因（高达 2 mg/kg）以缓解疼痛。用手术钉或伤口夹缝合皮肤。 4.恢复和再灌注 将鼠标放回循环水毯、暖手器或其他适当热源上的温暖室或笼子中。以每升腔室容积的流速输送 21% O2 ，流速为 0.5 L/min。让鼠标在这里恢复 90 分钟。每 5-10 分钟监测一次鼠标是否有疼痛或痛苦的迹象，例如驼背姿势、眯眼和不愿移动。 5. 安乐死和采血 在90分钟恢复期结束时，将小鼠返回诱导室，并以0.5L / min的腔室容积速率提供2%-4%异氟醚和21%O2 ，以重新诱导完全麻醉。 将动物转移回手术区域，并用鼻锥装上鼻锥，提供 2%-4% 异氟醚和 21% O2 以实现深度麻醉。注意：CO2 不是此程序的合适安乐死方法，因为它会引起生理变化，这可能会干扰缺血性损伤或组织分析物13。 重新打开腹侧中线切口，并使用 23 G 针头和注射器从腹腔静脉收集尽可能多的血液，进行终末出血。预计收集 0.3-0.5 mL 血液（在接受 IRI 的小鼠中较少，在接受假剖腹手术的小鼠中更多）。注意：终末出血的目的是帮助人道安乐死，并收集和保存血液以备将来检测（即血清化学、PCR、ELISA）。 采血后，腹主动脉被切断以允许完全放血。 进行颈椎脱位或开胸手术作为辅助措施，以确保成功安乐死。 6. 组织学组织处理 安乐死后，收集所需的组织。确保及时完成组织处理，因为自溶在死亡后立即开始14,15。肠：收集小肠和大肠的整个长度。丢弃盲肠。 肝脏：收集左外侧叶、左正中叶和右正中叶。 肾脏：收集两个肾脏。按照惯例，在尸检时将左肾纵向切开，右肾作为横截面切开。注意：结肠、肝脏和肾脏可用于评估 IRI 的多器官衰竭或其他全身影响。小肠用于评估原发性损伤。没有必要跟踪肝叶和肾脏的各个部分，因为每个器官都将作为一个单元进行分析和评分。然而，肠段应分开，然后单独标记和评分。 将肠道分为四个部分：十二指肠、空肠、回肠和结肠。确保三个小肠段的长度相等。通过将小肠折叠成“Z”形来做到这一点，其中顶线是十二指肠，中间线是空肠，底线是回肠。跟踪近端与远端很重要。 使用装有 20 G 血管导管的 10 mL 注射器用生理盐水冲洗肠段腔。 在切片之前，将每个肠段平放，管腔面朝上。使用贴有 27 G 针头的 3 mL 注射器，并大量滴加 10% 缓冲福尔马林以覆盖粘膜的整个长度。然后，将每个肠段单独滚动并放入单独的标记组织盒中。要滚动，请将每个部分平放，管腔面朝上，然后绕牙签圆周滚动。近端部分应形成卷的内部。管腔应朝向内侧/中心。尽量轻柔地滚动，以免压缩绒毛。 卷起后，肠子应该看起来像瑞士卷。将瑞士卷螺旋面朝上放入盒内。 将组织放入装有10%缓冲福尔马林的标记小瓶中，以在室温下固定。过度固定总比固定不足好。小瓶应该很大，含有大量的福尔马林——至少比组织多 20 倍。肠：将四个盒放在一起放在标本杯中。固定 24-48 小时。 肝脏：将肝叶一起放入 50 mL 锥形管中。固定 24-48 小时。 肾脏：将肾脏一起放入 50 mL 锥形管中。固定 48-72 小时。注意：未修剪的肾脏比修剪的肾脏需要更长的时间来修复。为了将固定时间缩短至24-48小时，可以沿正中平面，纵向（左肾）和横向（右肾）切割肾脏，并在沉积在福尔马林之前放置在盒中。 将组织固定在福尔马林中指定时间后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）或蒸馏水冲洗，然后转移到装有70%EtOH的标记小瓶中。在等待组织学的同时，组织可以在室温下无限期地储存在 EtOH 中。肠：将四个盒放在一起放在标本杯中。 肝脏：将肝叶一起放入 50 mL 锥形管中。 肾脏：将肾脏一起放入 50 mL 锥形管中。 准备好后，使用苏木精和伊红 （H&E） 染色将组织处理到载玻片上。修剪福尔马林固定的组织，然后将它们嵌入石蜡中。将五微米切片安装在载玻片上并用 H&E 染色。 7. 组织评分 组织评分最好由对样本组不知情的有经验的人员进行。 使用 Chiu/Park 评分系统对肠缺血进行评分17。 使用 Jablonski 评分系统18,19 对肾脏损伤进行评分。 使用铃木评分系统20,21对肝损伤进行评分。注意：目前有许多评分系统用于评估肠道 IRI 啮齿动物模型中的组织损伤。本研究中使用的评分系统被选择，以尽量减少任意估计并最大限度地提高有意的定性评估（表1）。