상장간막 동맥의 폐색을 통한 장 허혈-재관류 손상의 설치류 모델

여기에 설명된 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute) 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 실험 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책(The Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals), 동물 복지법(The Animal Welfare Act) 및 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 요약된 정책을 준수합니다. 1. 수술 설정 무균 절차를 따르십시오. 마스크, 머리 커버, 깨끗한 점프수트/실험복/수술용 스크럽을 착용하십시오. 수술 기구( 재료 표 참조), 따뜻한 식염수, 면봉, 거즈, 수술용 스테이플, 수술용 커튼 및 장갑과 같은 멸균 재료를 준비하십시오. 또한 멸균할 필요가 없는 수술용 테이프를 구하십시오. 오토클레이브 또는 에틸렌옥사이드 멸균 기술로 재료를 멸균합니다. 수술 부위에 가열된 순환 물 담요를 놓고 멸균 수건이나 드레이프로 덮습니다. 정밀 이소플루란 기화기, 가압 의료용 공기(21%O2) 및 외과적 마취를 제공하기 위해 생쥐용으로 설계된 노즈콘이 있는 Bain 비재호흡 회로를 사용하십시오. 2. 동물 준비 챔버 부피 1리터당 0.5L/min의 속도로 2%-4% 이소플루란과 21%O2 의료용 공기를 전달하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다.알림: 혈액을O2로 포화시키면 IRI를 방해할 수 있으므로 이 특정 모델의 경우 2%O2 이상의 100%O2 의료용 공기를 사용하는 것이 바람직합니다. 챔버에서 마우스를 제거하고 수술 부위와 분리된 깨끗한 표면으로 옮깁니다. 1.5 % 이소플루란과 21 % O2 의료용 공기를 전달하는 노즈 콘에 장착하십시오. 1mg/kg 부프레노르핀을 등쪽 경추 부위에 피하 주사합니다. 200-600 IU/kg 헤파린을 복강내로 주사하여 폐색 기간 동안 혈전 형성을 방지합니다. 각막 손상을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 가위를 사용하여 복부의 털을 제거합니다. 수술 부위의 가열된 물 담요 위로 마우스를 이동합니다. 다시 말하지만, 1.5% 이소플루란과 21%O2 의료용 공기를 전달하는 노즈콘을 장착하여 수술 마취면을 달성합니다. 마우스를 등쪽 누운 곳에 놓고 수술용 테이프로 팔다리를 테이블에 고정합니다. 설치류 전용 체온계를 사용하여 동물의 체온을 직장에서 모니터링합니다. 수술 기간 내내 체온을 36.5 ± 0.5 °C로 유지하십시오. 클로르헥시딘 스크럽 또는 포비돈 요오드 스크럽에 적신 멸균 거즈를 사용하여 복부를 소독한 다음 70% 알코올을 뿌립니다. 이 순서를 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 세 번 반복합니다. 매번 새로운 스크럽 세트와 알코올 거즈를 사용해야 합니다.스크럽과 알코올을 수술 부위 중앙의 작은 원에서 시작하여 원의 크기를 늘려 가장자리를 향해 점차적으로 원을 그리며 바릅니다. 수술 부위의 가장자리에 도달하면 거즈를 버리십시오. 가장자리에서 중앙으로 뒤로 문지르지 마십시오. 발가락 꼬집기 테스트(페달 반사)를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인합니다. 멸균 장갑을 착용하십시오. 수술 부위를 무균으로 드레이프합니다. 3. 수술 및 허혈 #3 메스 칼날을 사용하여 피부에 15cm의 복부 정중선 절개를 하고 아래 근육 근막에서 자유롭게 해부하고 측면으로 반사합니다. 마이크로 해부 가위 또는 스프링이 장착된 마이크로 가위를 사용하여 linea alba를 따라 복벽을 통해 절개를 계속하고 견인기를 제자리에 놓습니다. 따뜻한 멸균 식염수를 적신 멸균 거즈 패드를 수술 부위 주변에 놓습니다. 복강에서 소장을 제거하고 두개골과 동물의 왼쪽으로 뒤집은 다음 축축한 패드 위에 놓습니다. 건조를 방지하기 위해 다른 축축한 거즈 패드를 조직 위에 놓습니다. 조직을 촉촉하게 유지하기 위해 거즈에 따뜻한 멸균 식염수를 주기적으로 떨어뜨립니다. 하대정맥의 복부, 복강동맥의 꼬리, 신장 동맥의 두개골에 위치한 SMA를 분리합니다.참고: 그림 1 은 수술 중 분리된 SMA의 위치를 보여줍니다. SMA는 일반적으로 하대정맥의 복부에 있으며 오른쪽으로 뻗어 있습니다. 수술 중 장이 바깥쪽으로 나오고 왼쪽으로 뒤집히면 SMA는 하대정맥의 왼쪽에 위치합니다. 비외상성 미세혈관 클립이 복부 대동맥에서 갈라지는 SMA 기저부를 가로질러 클립이 상장간막 정맥을 막지 않도록 합니다. 분홍색에서 옅은 흰색으로 색이 변하고 장간막 맥박이 소실되는 것을 관찰하여 소장의 허혈을 확인합니다. 허혈성 기간 동안 내장을 복강 내부의 원래 위치로 되돌립니다. 견인기를 제거하고 절개 부위를 축축한 거즈로 덮습니다. 건조를 방지하고 체온을 유지하기 위해 거즈에 따뜻한 멸균 식염수를 주기적으로 첨가하십시오. 45분 동안 허혈이 발생한 후(클립의 초기 적용으로 시작됨) 폐색 클립을 제거합니다. 장간막 맥박과 홍조를 관찰하여 혈류의 회복을 확인합니다. 적절한 수분을 유지하기 위해 최종 봉합 직전에 복강내 따뜻한 멸균 식염수를 도포합니다. 6-0 폴리글락틴 910 봉합사로 복부 근육을 닫습니다. 통증 완화를 위해 근육 절개 라인을 따라 bupivacaine(최대 2mg/kg)을 투여합니다. 수술용 스테이플이나 상처 클립으로 피부를 닫습니다. 4. 회복과 재관류 마우스를 순환 물 담요, 손난로 또는 기타 적절한 열원의 따뜻한 챔버 또는 케이지로 되돌립니다. 챔버 부피의 각 리터에 대해 0.5L/min의 유속으로 21%O2 를 전달합니다. 여기서 마우스를 90분 동안 복구합니다. 5-10분마다 마우스를 모니터링하여 구부정한 자세, 곁눈질, 움직임 거부와 같은 통증이나 고통의 징후가 있는지 확인합니다. 5. 안락사와 채혈 90분의 회복 기간이 끝나면 마우스를 유도 챔버로 되돌리고 챔버 부피의 0.5L/min의 속도로 2%-4% 이소플루란과 21%O2 를 전달하여 완전 마취를 다시 유도합니다. 동물을 수술 부위로 다시 옮기고 깊은 마취를 위해 2%-4% 이소플루란과 21%O2 를 전달하는 노즈콘을 맞춥니다.참고: CO2 는 허혈성 손상 또는 조직 분석물을 방해할 수 있는 생리학적 변화를 유도하기 때문에 이 절차에 적합한 안락사 방법이 아니다13. 복부 정중선 절개 부위를 다시 열고 23G 바늘과 주사기를 사용하여 복정맥에서 가능한 한 많은 혈액을 채취하여 말단 출혈을 수행합니다. 0.3-0.5mL의 혈액을 수집할 것으로 예상됩니다(IRI를 받은 마우스에서는 더 적고 가짜 개복술을 받은 마우스에서는 더 많음).참고: 말단 출혈의 목적은 인도적인 안락사를 돕고 향후 검사(예: 혈청 화학, PCR, ELISA)를 위해 혈액을 수집 및 보존하는 것입니다. 채혈 후 복부 대동맥을 절단하여 완전한 출혈을 가능하게 합니다. 성공적인 안락사를 보장하기 위한 2차 조치로 자궁경부 탈구 또는 개흉술을 수행합니다. 6. 조직학을 위한 조직 가공 안락사 후 원하는 조직을 채취합니다. 사망 직후 자가분해가 시작되므로 조직 처리가 즉시 수행되도록 하십시오14,15.창자: 소장과 대장의 전체 길이를 수집합니다. 맹장을 버리십시오. 간: 좌측, 좌측 정중엽, 우측 정중엽을 수집합니다. 신장: 양쪽 신장을 모두 모은다. 관례에 따라 왼쪽 신장은 세로로 절단하고 오른쪽 신장은 부검시 단면으로 절단합니다.참고: 결장, 간 및 신장은 IRI의 다발성 장기 부전 또는 기타 전신 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 소장은 원발성 손상을 평가하는 데 사용됩니다. 간엽과 신장의 개별 부분을 추적할 필요가 없으며, 각 장기가 하나의 단위로 분석되고 점수가 매겨집니다. 그러나 장 분절은 별도로 보관한 다음 개별적으로 라벨을 붙이고 점수를 매겨야 합니다. 장을 십이지장, 제주눔, 회장, 결장의 네 부분으로 나눕니다. 세 개의 소장 분절의 길이가 같은지 확인하십시오. 소장을 “Z”자 모양으로 접어 위쪽 선은 십이지장, 중간 선은 제주눔, 아래쪽 선은 회장입니다. 근위부와 원위부를 추적하는 것이 중요합니다. 20G 혈관 카테터가 부착된 10mL 주사기를 사용하여 장 분절의 내강을 식염수로 씻어냅니다. 절편을 만들기 전에 각 장 부분을 발광 면이 위를 향하도록 평평하게 놓습니다. 27G 바늘에 부착된 3mL 주사기를 사용하여 10% 완충 포르말린을 넉넉하게 적하하여 점막의 전체 길이를 코팅합니다. 그런 다음 각 장 분절을 개별적으로 말아서 라벨이 붙은 별도의 조직 카세트에 넣습니다.굴리려면 각 세그먼트를 발광 면이 위를 향하도록 평평하게 놓은 다음 이쑤시개 주위를 원주곡으로 굴립니다. 근위 부분은 롤의 내부 부분을 형성해야 합니다. 루멘은 안쪽/중앙을 향해야 합니다. 융모가 압박되지 않도록 가능한 한 부드럽게 굴리십시오. 굴렸을 때 장은 스위스 롤처럼 보여야 합니다. 스위스 롤 나선형을 앞면이 위로 향하게 하여 카세트 안에 놓습니다. 10% 완충 포르말린으로 채워진 라벨이 붙은 바이알에 조직을 넣어 실온에서 고정합니다. 과잉 고정은 과소 고정보다 낫습니다. 바이알은 크고, 포르말린이 많이 함유되어 있어야 하며, 티슈보다 최소 20배 이상 고정성이 있어야 합니다.내장: 4개의 카세트를 표본 컵에 함께 넣습니다. 24-48시간 동안 수정합니다. 간: 간엽을 50mL 원뿔형 튜브에 함께 넣습니다. 24-48시간 동안 수정합니다. 신장: 50mL 원뿔형 튜브에 신장을 함께 넣습니다. 48-72시간 동안 수정합니다.참고: 다듬어지지 않은 신장은 다듬어진 신장보다 고치는 데 시간이 더 오래 걸립니다. 고정 시간을 24-48시간으로 단축하기 위해 신장을 정중면을 따라 세로(왼쪽 신장) 및 가로(오른쪽 신장)로 절단하고 포르말린에 침착하기 전에 카세트에 넣을 수 있습니다. 지정된 시간 동안 조직을 포르말린에 고정한 후 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 증류수로 헹구고 70% EtOH로 채워진 라벨이 부착된 바이알로 옮깁니다. 조직은 조직학을 기다리는 동안 실온에서 EtOH에 무기한 보관할 수 있습니다.내장: 4개의 카세트를 표본 컵에 함께 넣습니다. 간: 간엽을 50mL 원뿔형 튜브에 함께 넣습니다. 신장: 50mL 원뿔형 튜브에 신장을 함께 넣습니다. 준비가 되면 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 유리 슬라이드에서 조직을 처리합니다. 포르말린으로 고정된 조직을 다듬은 다음 파라핀에 넣습니다. 슬라이드에 5미크론 섹션을 장착하고 H&E로 염색합니다. 7. 조직 점수 매기기 조직 채점은 샘플 그룹에 대해 눈이 먼 숙련된 직원이 수행하는 것이 좋습니다. 장 허혈은 Chiu/Park 채점 시스템17을 사용하여 채점한다. 신장 손상은 Jablonski 채점 시스템18,19를 사용하여 채점됩니다. 간 손상은 스즈키 채점 시스템20,21을 사용하여 채점됩니다.참고: 현재 장 IRI의 설치류 모델에서 조직 손상을 평가하기 위해 많은 채점 시스템이 사용되고 있습니다. 본 연구에서 사용한 채점체계는 자의적 추정을 최소화하고 의도적 정성적 평가를 극대화하기 위해 선정하였다(표 1).