Dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive Chambre de 8 puits

1. Dans la formation de biofilms in vitro Les colonies bactériennes (qui ont été cultivés sur gélose appropriée durant la nuit), ont été suspendues dans les médias et la DO 490 a été ajusté à 0,65 La suspension résultante bactérienne est ensuite diluée 1:6 (1 ml de suspension bactérienne + 5 ml préchauffé moyenne) et incubées à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant environ 3 heures pour atteindre la mi-phase log. Diluer le 1:2500 mi-log croissance en suspension avec des pré-chauffé les médias et le lieu 200 ul de dilution dans chaque puits d'une lame de chambre 8-même. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Après environ 16 heures, moyenne aspirer à partir du coin de chaque chambre et ajouter 200 ul frais, pré-chauffé moyen – long dispenser paroi de la chambre afin de ne pas créer des forces de cisaillement dans la chambre qui pourrait perturber le biofilm. Si l'incubation de plus de 24 heures, changement de milieu tous les 12 heures ou au besoin pour maintenir la viabilité bactérienne. 2. Visualisation des biofilms Aspirer moyennes de chaque chambre, comme décrit ci-dessus, et laver deux fois par biofilm résidents doucement avec une solution saline stérile. Ajouter 200 ul de BacLight Live / Dead tache (3 uL composante A + 3 B composante ul par ml de solution saline) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Protéger la culture de la lumière à partir de ce point. Aspirer la tache et laver deux fois délicatement avec une solution saline stérile comme avant. Ajouter 200 ul du formol tamponné neutre à chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante pour fixer spécimen. Retirer fixateur et éliminer correctement conformément aux directives institutionnelles. Laver deux fois avec une solution saline et d'éliminer les fluides de lavage qui contiennent du formol comme ci-dessus. Retirez le puits en plastique de la lame, ajouter suffisamment de solution saline pour chaque puits de sorte que quand une lamelle est placée sur le joint, pas de bulles d'air sont présents. Lamelle et sceller les bords de la lamelle avec un milieu de montage. Le vernis à ongles peut être utilisée pour sceller les diapositives cependant les diapositives ne seront pas aussi permanente. Laisser le scellant sécher pendant environ 1 heure avant d'examiner par microscopie. 3. Résultats Figure 1. Représentant 3D des images composites d'un biofilm formé dans une chambre de diapositives 8-même. Les bactéries ont été marqués avec Live / Dead tache où des bactéries vivantes fluorescence verte et les bactéries mortes émettent une fluorescence rouge. (A) Image composite du biofilm ensemble montrant l'architecture distincte avec des tours et des canaux d'eau. (B) Même que dans le biofilm (A), maintenant vu en coupe transversale.