En la formación de biofilm in vitro en una diapositiva Cámara de 8 pocillos

1. En la formación de biofilm in vitro Colonias de bacterias (que han sido cultivados en agar apropiado durante la noche), se suspendieron en los medios de comunicación y el OD 490 se ajustó a 0,65 La suspensión bacteriana resultante se diluyó 1:6 (1 ml de suspensión bacteriana + 5 ml pre-calentado medio) y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 durante aproximadamente 3 horas para llegar a mediados de registro de fase. Diluir el 1:2500 crecimiento a mediados de registro de la suspensión con pre-calentado los medios de comunicación y el lugar 200 l de la dilución en cada pocillo de una diapositiva de cámara de 8 pocillos. Se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Después de aproximadamente 16 horas, medio aspirado desde la esquina de cada cámara y añadir 200 l frescos, pre-calentado a medio – largo de la pared prescindir de la cámara a fin de no crear fuerzas de corte dentro de la cámara que podría interrumpir la biopelícula. Si la incubación de más de 24 horas, cambio de medio cada 12 horas o según sea necesario para mantener la viabilidad bacteriana. 2. Visualización de Biofilm Aspirar medio de cada cámara, como se describió anteriormente, y lavar biofilm residentes dos veces suavemente con solución salina estéril. Añadir 200 uL de BacLight Live / Dead mancha (3 l componente A + componente B 3 L por ml de solución salina) a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Proteger la cultura de la luz a partir de este punto. Aspirar la mancha y lave dos veces suavemente con solución salina estéril como antes. Añadir 200 l de formalina neutra tamponada a cada pocillo e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar la muestra. Retire el fijador y como deshacerse de conformidad con las directrices institucionales. Lavar dos veces con solución salina y disponer de los líquidos de lavado que contienen formol que el anterior. Eliminar los pozos de plástico de la diapositiva, añadir una cantidad suficiente de solución salina en cada pocillo de modo que cuando un cubreobjetos se coloca en la junta, no hay burbujas de aire. Cubreobjetos y sellar los bordes del cubreobjetos con medio de montaje. Esmalte de uñas puede ser usado para sellar las diapositivas de las diapositivas sin embargo no será tan permanente. Deje que el sellador se seque por aproximadamente 1 hora antes de examinar a través de microscopía. 3. Resultados Figura 1. Representante de imágenes en 3D compuestas de una formación de biopelículas en una diapositiva de cámara de 8 pocillos. Las bacterias se marcaron con Live / Dead mancha bacterias vivas en el que las bacterias verdes fluorescentes y los muertos fluorescencia roja. (A) Imagen compuesta de biofilm completo que muestra la arquitectura distinta, con torres y canales de agua. (B) Lo mismo que en el biofilm (A), ahora se ve en sección transversal.