In vitro a formação de biofilme em um slide Câmara de 8 poços

1. In Vitro formação de biofilme Colônias de bactérias (que foram cultivadas em ágar apropriado durante a noite), foram suspensas em mídia e do OD 490 foi ajustado para 0,65 A suspensão resultante bacteriana foi então diluída 1:06 (1 mL de suspensão bacteriana + 5 mL de médio pré-aquecido) e incubados a 37 ° C com 5% de CO 2 por aproximadamente 3 horas para chegar log-mid fase. Diluir o log-mid 1:2.500 suspensão crescimento com pré-aquecido media e colocar 200 mL da diluição em cada poço de uma câmara de corrediça 8-bem. Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. Após aproximadamente 16 horas, médio aspirado de canto de cada câmara e adicionar 200 mL fresco, médio pré-aquecido – dispensar ao longo da parede da câmara de modo a não criar uma força de cisalhamento dentro da câmara, que poderia interromper o biofilme. Se incubar mais de 24 horas, a mudança média a cada 12 horas ou conforme necessário para manter a viabilidade bacteriana. 2. Visualização de biofilme Aspirar médio de cada câmara, como descrito acima, e lavar biofilme residente duas vezes delicadamente com soro fisiológico estéril. Adicionar 200 mL de BacLight Live / Morto mancha (3 mL componente A + 3 B componente mL por mL de solução salina) para cada poço e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Proteger a cultura da luz a partir deste ponto em diante. Aspirar a mancha e lave delicadamente duas vezes com solução salina estéril como antes. Adicionar 200 mL de formalina tamponada neutra a cada poço e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente para corrigir espécime. Remover fixador e descartar corretamente de acordo com as diretrizes institucionais. Lavar duas vezes com solução salina e descarte dos fluidos de lavagem que contêm formol como acima. Remove os poços de plástico do slide, adicionar bastante soro fisiológico para cada poço de modo que quando uma lamela é colocado sobre a junta, sem bolhas de ar estão presentes. Lamínula e vedação das bordas da lamínula com meio de montagem. Unha polonês pode ser usado para selar o slides no entanto os slides não será tão permanente. Permitir que o selante para secar por aproximadamente 1 hora antes do exame através de microscopia. 3. Resultados Figura 1. Representante 3D imagens compostas de um biofilme formado em um slide de câmara de 8 poços. As bactérias foram rotulados com o Live / Dead mancha onde vivem bactérias fluorescentes e bactérias verdes mortos fluorescência vermelha. (A) Imagem composta de biofilme inteiro mostrando a arquitetura distinta, com torres e canais de água. (B) O mesmo que no biofilme (A), agora visto na seção transversal.