В пробирке образование биопленки в 8-и палаты слайдов

1. В формировании биопленки Vitro Бактериальные колонии (которые были выращены на соответствующие агар на ночь), были приостановлены в средствах массовой информации и OD 490 доводили до 0,65 В результате бактериальной суспензии разбавляют 1:6 (1 мл бактериальной суспензии + 5 мл подогретого среды) и инкубировали при 37 ° C с 5% CO 2 примерно на 3 часа, чтобы достичь середины логарифмической фазы. Развести середине журнала роста подвески 1:2500 с подогретого СМИ и месте 200 мкл в каждую лунку 8-а камера слайд. Инкубировать при 37 ° C с 5% CO 2. Примерно через 16 часов, аспирация среды от углу каждой камеры и добавить 200 мкл свежей, подогретого средне – обойтись вдоль стены камеры, чтобы не создавать силы сдвига в камеру, которая может нарушить биопленки. Если инкубацию более 24 часов, изменение среды каждые 12 часов или по мере необходимости для поддержания жизнеспособности бактериальных. 2. Визуализация биопленки Аспирируйте среды от каждой камеры, как описано выше, и мыть резидент биопленки дважды мягко стерильным физиологическим раствором. Добавить 200 мкл BacLight Live / Мертвое пятно (3 мкл компонент + 3 мкл B компонент на мл физиологического раствора) в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. Защитить культуру от света от этого момента. Аспирируйте пятна и мыть дважды мягко стерильным физиологическим раствором, как раньше. Добавить 200 мкл нейтральных буферный формалин в каждую лунку и инкубировать 30 минут при комнатной температуре, чтобы исправить образца. Удалить фиксатор и правильно распоряжаться в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Промыть два раза физиологическим раствором и распоряжаться мыть жидкостями, содержащими формалин, что и выше. Удалите пластиковую скважин слайдов, добавить достаточно соленый в каждую лунку так, что когда покровное делается на прокладку, без воздушных пузырьков присутствуют. Покровное и печатью края покровного стекла с монтажной средой. Лак для ногтей может быть использована для уплотнения слайды однако слайды не будут постоянными. Разрешить герметик высохнуть в течение примерно 1 час до рассмотрения по микроскопии. 3. Результаты Рисунок 1. Представителю 3D композитные изображения биопленки образуются в 8-и камер слайда. Бактерии были помечены Live / Мертвое пятно которой живые бактерии светиться зеленым и мертвые бактерии светиться красным цветом. () Композитный образы всего биопленки показывающие различные архитектуры с башнями и водных каналов. (Б) То же, биопленки, как в (А), в настоящее время рассматривается в поперечном сечении.