Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Deneysel prosedürün genel bir görünümü Şekil 1A’da grafiksel olarak gösterilmiştir. Kullanılan canlı hayvanların işlenmesiyle ilgili tüm deneyler, Alman Hayvanları Koruma Kanunu’na sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirilmiş ve Berlin’deki Sağlık ve Sosyal Hizmetler Bölge Ofisi (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Fareler, Max Delbrück Moleküler Tıp Merkezi’nin (MDC) hayvan çekirdek tesisinde 12:12 saat aydınlık/karanlık döngüsü ile standart laboratuvar koşulları altında havalandırmalı kafeslerde grup halinde barındırıldı. Yiyecek ve su ad libitum olarak sağlandı.Tamponların ve reaktiflerin bileşimi için Tablo 1’e ve bu protokolde kullanılan tüm reaktifler, aletler ve malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. vGLUT1’e özgü test için, akış sitometrisinin doku homojenizasyonu ve hücre izolasyonu gerektirdiğini ve mikroglia’nın izolasyon prosedüründen sonra yaklaşık% 95 canlılık gösterdiğini kabul etmek için el yazması boyunca in vivo* terimini kullandık (Şekil 1B ve Ek Şekil S1). Bu nedenle, fiksasyona kadar kısa bir süre için sinaptik materyali ex vivo olarak yutma yeteneklerini korurlar. Bu nedenle, vGLUT1 + mikroglia’nın miktar tayini, fiksasyon adımına kadar hem in vivo hem de kısa süreli ex vivo yutmayı içerir. 1. Glutamaterjik sinapsların mikroglia tarafından in vivo * yutulmasının tespiti için hücre içi vGLUT1 boyama NOT: Aşağıdaki hücre izolasyon prosedürü16’dan uyarlanmıştır. Hücre izolasyonunun tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. Pentobarbitalin intraperitoneal enjeksiyonunu kullanarak fareleri uyuşturun. Fareleri 10 mL buz gibi Dulbecco’nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile ~ 2 dakika boyunca intrakardiyal olarak perfüze edin.NOT: Örnek (n) başına bir fare kullanılır. Beyni kafatasından çıkarın ve 1 mL nöral hücre ortamında koruyun.NOT: Hibernate-A ortamı gibi nöral hücre ortamı, doku ayrışma sürecini takiben hücrelerin yüksek canlılığını sağlamak için kullanılır. Beyni, 1 mL buz gibi soğuk nöral hücre ortamı ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın ve hipokampusu daha önce tarif edildiği gibiinceleyin 17. Hipokampusu 1 mL nöral hücre ortamı ile doldurulmuş bir Dounce homojenizatöre aktarın ve yaklaşık ~ 25 hafif vuruşla gevşek havaneli kullanarak dokuyu ayırın. 5 mL’lik bir polipropilen tüpe 70 μm’lik bir süzgeç yerleştirin ve 500 μL nöral hücre ortamı ekleyin. Doku homojenatını süzgeçten geçirerek 5 mL’lik polipropilen tüpe aktarın. Dounce homojenizatörü 2x’i 1 mL soğuk nöral hücre ortamı ile durulayın ve numuneleri 400 × g’da 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti nazik pipetleme yoluyla 500 μL buz gibi DPBS’de yeniden süspanse edin. Homojen bir süspansiyon sağlayın ve DPBS kullanarak son hacmi 1,5 mL’ye tamamlayın. Numuneye 500 μL izotonik Percoll çözeltisi ekleyin, hafifçe yeniden süspanse edin ve 2 ml daha soğuk DPBS ile kaplayın. Numuneleri 3.000 × g’da 10 dakika boyunca tam hızlanma ve fren olmadan santrifüjleyin. Orta fazda üst tabakayı ve miyelin diskini aspire edin.NOT: Aşağıdaki tüm santrifüjleme adımları, aksi belirtilmedikçe 4 ° C’degerçekleştirilir. 4 mL soğuk DPBS ekleyin ve numuneleri 400 × g’da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 100 μL sabitlenebilir canlılık boyama çözeltisinde yeniden süspanse edin ve numuneleri 4 ° C’de 30 dakika inkübe edin. Numuneye 1 mL soğuk DPBS ekleyin ve numuneleri 300 × g’da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 100 μL CD16 / CD32 boyama çözeltisi (FACS tamponunda 1/200) ekleyin. ~5 saniye vorteksleyin ve 4 °C’de 10 dakika inkübe edin.NOT: CD16 / CD32 boyama, akış sitometrisi gibi uygulamalardan önce antikorların mikroglia gibi FcR taşıyan hücrelere spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmek için bir ön işlemdir. Numuneye 1 mL FACS tamponu ekleyin ve 300 × g’da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve 100 μL boyama ana karışımı-I ekleyin (1x FACS Tamponunda 1/100 anti-CD11b / anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C / anti-Ly6G). Numuneleri karanlıkta 4°C’de 20 dakika inkübe edin. Numuneye 1 mL FACS tamponu ekleyin ve 300 × g’da 5 dakika santrifüjleyin. Peleti 250 μL fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin. 4 °C’de 25 dakika inkübe edin. 2 mL 1x geçirgenleştirme (PERM) Tamponu ekleyin ve 300 × g 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 100 μL vGLUT1 veya izotip kontrol boyama solüsyonu ekleyin. ~5 saniye vorteksleyin ve numuneleri 4 °C’de 50 dakika inkübe edin. 2 mL 1x PERM Tamponu ekleyin ve 300 × g 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve numunelere 2 mL FACS tamponu ekleyin. 300 × g’da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 250 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri 40 μm’lik bir süzgeç filtresinden geçirin. Akış sitometrisi kullanarak tek/canlı/CD1b++/CD45+ mikrogliadan vGLUT1 floresan yoğunluğunu analiz edin. Dalak makrofajlarını her deney için negatif kontrol olarak kullanın.Kıyılmış dalak dokusunu 70 μm’lik bir süzgeç filtresinden iki kez hafifçe sıkıştırarak splenositleri izole edin. Filtreleri 40 mL DPBS ile durulayın ve süspansiyonu 50 mL’lik konik bir tüpte toplayın. 350 × g’yi 10 dakika santrifüjleyin ve elde edilen peleti 1 mL’lik bir kırmızı kan hücresi lizis tamponu çözeltisinde yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra numuneye 10 mL DPBS ekleyin ve 350 × g’da 10 dakika santrifüjleyin. 1.11 ve 1.17 adımları arasında açıklanan boyama adımlarına devam edin.NOT: Geçit stratejisi, dalak makrofajlarını CD11b ++/ CD45 ++/ Canlı hücre popülasyonu olarak tanımlamak için Ek Şekil S2’de verilmiştir. Geçit stratejisi (Şekil 1)Birincil kapı: İleri Saçılma Alanını (FSC-A) [x ekseni] ve Yan Saçılma Alanını (SSC-A) [y ekseni] kapılı alana mikroglia popülasyonunu dahil edecek ve hücresel kalıntıları hariç tutacak şekilde ayarlayın. Çiftleri hariç tutmak için İleri Saçılma Alanını (FSC-A) [x ekseni] ve İleri Saçılma Yüksekliğini (FSC-H) [y ekseni] ayarlayın. Tekliler bu nokta grafiğinde köşegen olarak görünür. CD11b-PECy7 [y ekseni] ve CD45-APC’yi [x ekseni] ayarlayın ve popülasyonu yüksek yüzey seviyesi CD11b ve orta seviye CD45 ile mikroglia olarak kapılayın. FITC [y ekseni] negatif kapısındaki ölü hücreleri hariç tutun. İSTEĞE BAĞLI: CNS ile ilişkili makrofajları analizden çıkarmak için FITC negatif kapısında Ly6C- ve Ly6G-FITC için pozitif olan hücreleri de hariç tutun.NOT: Canlı hücrelerin aksine, zarları bozulmuş ölü hücreler, sabitlenebilir canlılık boyasının sitoplazmaya girmesine izin verir, bu da protein etiketlememiktarını artırır 18. Böylece ölü hücreler, tanımlanan kapıya dahil olan canlı hücrelerden daha parlak olacaktır. CD45-APC [x ekseni] ve vGLUT1-PE [y ekseni]’ni ayarlayın; dalak örneğinde herhangi bir pozitif olay tespit edilmediği eşik kapısının üzerindeki popülasyon (dahili biyolojik negatif kontrol, Şekil 1E), örnekteki vGLUT1-pozitif fraksiyon olarak kabul edilir. 2. Ham sinaptozomların mikroglia tarafından in vitro yutulmasının tespiti Ham sinaptozom hazırlama ve pHrodo Kırmızı etiketlemeNOT: Aşağıdaki tüm adımlar buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.1.1 ila 1.2 arasındaki adımları izleyin. Beyni 1 mL buz gibi soğuk nöral hücre ortamı ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın ve hipokampusu dikkatlice inceleyin. Petri kabını her zaman buz üzerinde tutun. Bir sonraki adımda mikroglia izolasyonu için hipokampi kullanın. Beynin geri kalanını (beyincik ve koku soğanı hariç) 1 mL sinaptik protein ekstraksiyon reaktifi ile doldurulmuş bir Dounce homojenizatöre aktarın ve gevşek havaneli kullanarak dokuyu yaklaşık ~ 30 vuruşla nazikçe ayırın. Ekstraksiyon reaktifinin 10 mL’si başına bir tablet proteaz inhibitörünü destekleyin ve sinaptozomları üreticinin talimatlarına göre izole edin.NOT: SynPER19 gibi sinaptik protein ekstraksiyon reaktifleri, biyolojik olarak aktif sinaptik öncesi ve sonrası proteinler içeren sinaptozomları hazırlamak için kullanılır. Ham sinaptozom peletini 500 μL 0.1 MNa2CO3çözeltisi içinde çözün. Sinaptozom örneğini 10 μL 0.2 mM pHrodo Kırmızısı ile boyayın. Ham sinaptozom örneklerini oda sıcaklığında (24-25 ° C) 1,5 saat hafif çalkalama ile inkübe edin. Numuneye 1 mL soğuk DPBS ekleyin, tam hızda (20.815 × g) 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Örneklerden bağlanmamış aşırı pHrodo Red’i çıkarmak için adım 2.1.5’i toplamda 7x tekrarlayın. Son santrifüjden sonra, numunenin protein konsantrasyonlarını ölçmek için standart bir BCA testi yapın. İsteğe bağlı: Sıvı nitrojen kullanarak DPBS’de sinaptozom örneklerini %5 DMSO ile dondurun ve -80 °C’de 3 hafta boyunca saklayın. Işığa maruz kalmayı minimumda tutmak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün. In vitro Yeni İzole Edilmiş Yetişkin Mikroglia Kullanılarak Ham Sinaptozom Yutulma TestiaCSF’yi hazırlayın ve 30 dakika boyunca% 95O:% 5CO2 ile dengeleyin.NOT: 2.2.2-2.2.4 adımları için, papain bazlı sindirim solüsyonunun hazırlanması için üreticinin talimatlarını izleyin. Papain kitindeki flakon 2’ye 4 mL aCSF ekleyin. Şişeyi, papain çözeltisi berrak görünene kadar ~ 10 dakika boyunca 37 ° C’lik bir su banyosuna yerleştirin. Papain kitindeki flakon 3’e 400 μL aCSF ekleyin. Yavaş pipetleme ile ~10 kez nazikçe karıştırın. Flakon 3’ten flakon 2’ye 200 μL ekleyin (adım 2.2.3’te yeniden yapılandırılmıştır). Şişenin geri kalanını saklayın 3. Adım 2.1.2’de diseke edilen hipokampusu alın ve disseke edilmiş hipokampusu bir neşter kullanarak kıyın. Kıyılmış hipokampusu, adım 2.2.5’te hazırlanan 2 mL enzim çözeltisi ile doldurulmuş bir doku ayrıştırıcı tüpe aktarın. Tüpü doku ayrıştırıcıya yerleştirin ve programı çalıştırın: 37C_ABDK_01 (~ 30 dakika sürer). Numuneleri ~20 dakika boyunca 37 °C’de bir su banyosuna koyun ve karışımı her 5 dakikada bir 1 mL’lik bir pipet kullanarak kabarcık oluşturmadan ezin.NOT: Etkili bir ayrışma sağlamak için doku tamamen ayrışana ve tamamen homojen görünene kadar bu işleme devam edilmelidir. Aşağıdaki tüm santrifüjleme adımları, aksi belirtilmedikçe 4 ° C’degerçekleştirilir. Bulanık hücre süspansiyonunu dikkatlice 15 mL’lik yeni bir tüpe çıkarın ve 300 × g’da 5 dakika santrifüjleyin. Bu 5 dakikalık süre boyunca, numune başına aşağıdaki yıkama karışımını (5 mL) hazırlayın; papain kitinde sağlanan 500 μL sulandırılmış albümin-ovomokoid inhibitör solüsyonunu 4.5 mL aCSF’ye ekleyin. Kalan çözeltiyi 2.2.5 adımındaki şişe 3’te yıkama karışımına ekleyin. Süpernatanı adım 2.2.8’den atın ve hücre peletini yıkama karışımı solüsyonunda hemen yeniden süspanse edin. Numuneyi 70 μm’lik bir filtreden 5 mL’lik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne geçirin. Numuneleri 300 × g’da 5 dakika santrifüjleyin. Daha önce adım 1.7-1.9’da açıklanan Percoll gradyan santrifüjleme adımıyla devam edin. Hücreleri MACS boyama tamponunda yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice yeniden süspanse edin. Numuneleri 4 °C’de 15 dakika inkübe edin. Her numuneye 1 mL MACS tamponu ekleyin ve 300 × g’da 8 dakika santrifüjleyin. Hücreleri 500 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin. Pozitif seçim sütunlarını manyetik ayırıcıya yerleştirin. Sütunları 3 mL MACS Tamponu ile durulayarak dengeleyin. Yavaşça karıştırın ve 500 μL hücre süspansiyonunu kolona uygulayın. Kolonları 3 mL MACS Tamponu ile 3x yıkayın. Sütunları manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 15 mL konik tüplerin üzerine yerleştirin. Kolona 5 mL MACS tamponu ekleyin ve hücreleri hemen bir dolgunlaştırıcı kullanarak yıkayın. Numuneleri 300 × g’da 10 dakika santrifüjleyin. Bu süre zarfında, DPBS’de 20 mL% 40 FBS hazırlayın. Numune başına 1 mL DMEM’i bir su banyosunda 37 °C’ye kadar önceden ısıtın. Son hücre peletini 1 mL önceden ısıtılmış DMEM’de çözün. 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 500 μL önceden ısıtılmış DMEM’de yaklaşık ~ 150.000-200.000 hücre tohumlayın. Kontrol olarak, 1-2 ekstra kuyucuğa benzer sayıda hücre tohumlayın. Bir ışık mikroskobu kullanarak tüm kuyucuklardaki hücrelerin birleşimini kontrol edin.NOT: Hedef beyin bölgesi hipokampus veya nispeten küçük beyin bölgeleri ise, ~ 150.000 mikroglia’yı izole etmek için örnek (n) başına 5 fare toplanabilir. Tüm beyin için, her iki izolasyon protokolünü kullanarak benzer sayıda hücre elde etmek için n’de 1 fare yeterli olacaktır. Alternatif olarak, yutma testini başlatmak için ~ 40.000 hücre, 100 μL nihai hacimde 96 oyuklu plakalarda kaplanabilir. Bu, analiz edilen hücre sayısını azaltır, ancak aynı zamanda n başına kullanılan fare sayısını da azaltır. DMEM’de FCS eksikliğine bağlı protein yoksunluğu fagositozu tetikleyecektir. Plakayı inkübatörde 1-2 saat inkübe edin (37 °C ve% 5 CO2).NOT: Bu adım, hücrelerin, fonksiyonel yutma testinin başlamasından önce izolasyon prosedürünün strese eğilimli etkilerinden kurtulmasını amaçlar. Her oyuktan çok yavaş bir şekilde 250 μL ortam alın, her oyuğa 250 μL taze önceden ısıtılmış DMEM ekleyin ve üstüne 3 μg pHRodo Kırmızı etiketli sinaptozom ekleyin. Bir ışık mikroskobu kullanarak tüm kuyucuklardaki hücre birleşmesini kontrol edin.Negatif kontrol kuyuları için, hücrelerle tohumlanmış ekstra kuyuya aynı miktarda etiketlenmemiş sinaptozom ekleyin. Test kuyuları için, kuyu 1’in yalnızca hücreler içerdiğinden emin olun; kuyu 2 hücreler + etiketlenmemiş sinaptozomlar içerir; kuyu-3 hücreler + 3 μg pHrodo Kırmızısı içerir; kuyu 4 DMEM + 3 μg pHrodo Red içerir. Hücreleri inkübatörde 2 saat boyunca sinaptozomlarla inkübe edin (37 ° C ve% 5 CO2). Ortamı çıkarın ve kuyuları soğuk DPBS ile yıkayın. Hücreleri 35 saniye ayırmak için oyuk başına 200 μL Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin. Oyuk başına DPBS’ye 1 mL FBS ekleyin ve hücreleri süzgeçten 5 mL’lik bir polipropilen tüpe aktarın. Hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırmak için bu işlem sırasında hem plakayı hem de tüpü buz üzerinde tutun. 500 μL buz gibi soğuk DPBS kullanarak her kuyuyu 2 kez yıkayın. Toplanan numuneleri 500 × g’da 5 dakika santrifüjleyin. 100 μL FACS tamponunda 1/200 CD16 / CD32 içeren boyama solüsyonundaki hücreleri yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her birinden 1/100 nihai konsantrasyon ile boyama çözeltisine CD11b ve CD45 ekleyin. Numuneleri karanlıkta 4 ° C’de 20 dakika inkübe edin. Numuneleri 1 mL FACS tamponu ile yıkayın ve 300 × g’da 10 dakika santrifüjleyin. Peleti 250 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi kullanarak en az 100.000 toplam olay kaydedin. CD11b ++ / CD45 + mikroglia’dan pHrodo Red floresan yoğunluğunu analiz edin. Geçit stratejisi (Şekil 2C)Birincil geçidi ayarlayın: İleri Saçılma Alanı (FSC-A) [x ekseni] ve Yan Saçılma Alanı (SSC-A) [x ekseni], kapılı alana mikroglia popülasyonunu dahil etmek ve hücresel kalıntıları hariç tutmak için. Çiftleri hariç tutmak için İleri Saçılma Alanını (FSC-A) [x ekseni] ve İleri Saçılma Yüksekliğini (FSC-H) [y ekseni] ayarlayın. Tekliler bu nokta grafiğinde köşegen olarak görünür. CD11b-PECy7 [y ekseni] ve CD45-APC’yi [x ekseni] ayarlayın ve popülasyonu yüksek yüzey seviyesi CD11b ve orta seviye CD45 ile mikroglia olarak kapılayın. Bu popülasyondan pHrodo-PE’nin medyan floresan yoğunluğunu hesaplayın. Negatif kontrol olarak etiketlenmemiş sinaptozomlarla inkübe edilmiş aynı hücreleri kullanın.