Количественная оценка поглощения микроглии синаптическим материалом с помощью проточной цитометрии

Общий вид экспериментальной процедуры графически проиллюстрирован на рисунке 1А. Все эксперименты по обращению с живыми животными проводились в строгом соответствии с Законом о защите животных и были одобрены Региональным управлением здравоохранения и социальных служб в Берлине (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Берлин, Германия). Мыши были помещены в вентилируемые клетки в стандартных лабораторных условиях с циклом свет/темнота 12:12 ч в центре животных Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка (MDC). Еда и вода предоставлялись в неограниченном количестве. В Таблице 1 приведен состав буферов и реагентов, а в Таблице материалов приведены подробные сведения обо всех реагентах, приборах и материалах, используемых в данном протоколе. Для анализа, специфичного для vGLUT1, мы использовали термин in vivo* на протяжении всей рукописи, чтобы признать, что проточная цитометрия требует гомогенизации тканей и выделения клеток, а микроглия демонстрирует примерно 95% жизнеспособности после процедуры выделения (рисунок 1B и дополнительный рисунок S1). Таким образом, они сохраняют свою способность поглощать синаптический материал ex vivo в течение короткого периода времени, вплоть до фиксации. Таким образом, количественное определение микроглии vGLUT1+ включает как in vivo , так и кратковременное поглощение ex vivo до стадии фиксации. 1. Внутриклеточное окрашивание vGLUT1 для выявления in vivo* поглощения глутаматергических синапсов микроглией ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура изоляции клеток адаптирована из16. Все этапы изоляции клеток должны проводиться на льду. Обезболивайте мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала. Перфузируйте мышей внутрисердечно 10 мл ледяного фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS) в течение ~2 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца используется одна мышь (n). Извлеките мозг из черепа и сохраните его в 1 мл среды нервных клеток.Примечание: Среда нервных клеток, такая как среда Hibernate-A, используется для обеспечения высокой жизнеспособности клеток после процесса диссоциации тканей. Перенесите мозг в чашку Петри, наполненную 1 мл ледяной нервной клеточной среды, и рассеките гиппокамп, как описано ранее17. Перенесите гиппокамп в гомогенизатор Dounce, наполненный 1 мл среды нервных клеток, и диссоциируйте ткань с помощью рыхлого пестика примерно ~25 легкими движениями. Поместите ситечко 70 мкм на полипропиленовую трубку объемом 5 мл и добавьте 500 мкл среды нервных клеток. Перенесите гомогенат ткани в полипропиленовую трубку объемом 5 мл через ситечко. Промойте гомогенизатор Dounce 2 раза 1 мл холодной среды нервных клеток и центрифугируйте образцы при 400 × г в течение 8 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл ледяного DPBS с помощью щадящего пипетирования. Обеспечьте однородную суспензию и доведите конечный объем до 1,5 мл с помощью DPBS. Добавьте в образец 500 μL изотонического раствора Перколла, аккуратно ресуспендируйте его и залейте еще 2 мл холодной DPBS. Центрифугируйте образцы при давлении 3 000 × g в течение 10 минут с полным ускорением и без торможения. Аспирируйте верхний слой, а также миелиновый диск в средней фазе.ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы центрифугирования выполняются при температуре 4 °C, если не указано иное. Добавьте 4 мл холодной DPBS и центрифугируйте образцы при давлении 400 × г в течение 10 минут. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 100 мкл раствора для окрашивания на приемлемую жизнеспособность и инкубируйте образцы в течение 30 мин при 4 °С. Добавьте к образцу 1 мл холодного DPBS и центрифугируйте образцы при 300 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 100 мкл раствора для окрашивания CD16/CD32 (1/200 в буфере FACS). Вортекс в течение ~5 с и инкубировать в течение 10 мин при 4 °C.Примечание: Окрашивание CD16/CD32 является предварительной обработкой для минимизации неспецифического связывания антител с FcR-содержащими клетками, такими как микроглия, перед применением, таким как проточная цитометрия. Добавьте в образец 1 мл буфера FACS и центрифугируйте при давлении 300 × г в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 100 мкл окрашивающей мастер-смеси-I (1/100 анти-CD11b/ анти-CD45 + 1/200 анти-Ly6C/ анти-Ly6G в 1x буфере FACS). Инкубируйте образцы в течение 20 минут при температуре 4°C в темноте. Добавьте в образец 1 мл буфера FACS и центрифугируйте при давлении 300 × г в течение 5 минут. Ресуспендируйте гранулу в 250 мкл фиксирующего буфера. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 25 минут. Добавьте 2 мл буфера для пермеабилизации (PERM) 1x и центрифугируйте 300 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 100 мкл vGLUT1 или раствора для контроля изотипа. Ввергните в вихрь в течение ~5 с и инкубируйте образцы при 4 °C в течение 50 минут. Добавьте 2 мл 1x PERM Buffer и центрифугируйте 300 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в образцы 2 мл буфера FACS. Центрифугируйте при 300 × г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте элементы в 250 мкл буфера FACS и пропустите образцы через фильтр с длиной 40 мкм. Анализ интенсивности флуоресценции vGLUT1 из одиночной/жизнеспособной/CD11b++/CD45+ микроглии с помощью проточной цитометрии. Используйте макрофаги селезенки в качестве отрицательного контроля для каждого эксперимента.Изолируйте спленоциты, дважды мягко сжимая измельченную ткань селезенки через фильтр-фильтр 70 мкм. Промойте фильтры 40 мл DPBS и соберите суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугировать 350 × г в течение 10 мин и ресуспендировать полученную гранулу в 1 мл раствора буфера для лизиса эритроцитов. Выдерживать 10 минут на льду. Добавьте 10 мл DPBS в образец после инкубации и центрифугируйте при 350 × г в течение 10 минут. Выполните шаги по окрашиванию, описанные между шагами 1.11 и 1.17.ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия гейтирования представлена на дополнительном рисунке S2 для определения макрофагов селезенки как популяции жизнеспособных клеток CD11b ++/ CD45 ++/. Стратегия стробирования (Рисунок 1)Первичный вентиль: Отрегулируйте переднюю область рассеяния (FSC-A) [ось x] и боковую зону рассеяния (SSC-A) [ось y], чтобы включить популяцию микроглии в закрытой области и исключить клеточный мусор. Отрегулируйте область прямого рассеяния (FSC-A) [ось x] и высоту прямого рассеивания (FSC-H) [ось y], чтобы исключить дублеты. Синглеты отображаются в виде диагонали на этой точечной диаграмме. Отрегулируйте CD11b-PECy7 [ось y] и CD45-APC [ось x] и зарегистрируйте популяцию с высоким уровнем поверхности CD11b и средним уровнем CD45 в виде микроглии. Исключите мертвые клетки в отрицательном затворе FITC[ось y]. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Также исключите клетки, положительные на Ly6C- и Ly6G-FITC в FITC-негативном затворе, чтобы исключить из анализа макрофаги, связанные с ЦНС.Примечание: В отличие от живых клеток, мертвые клетки с поврежденными мембранами позволяют корректируемому красителю жизнеспособности проникать в цитоплазму, что увеличивает количество мечения белка18. Таким образом, мертвые клетки будут ярче, чем живые, которые входят в определенный вентиль. Отрегулируйте CD45-APC [ось x] и vGLUT1-PE [ось y]; популяция, находящаяся выше пороговых ворот, в которой в образце селезенки не обнаружено положительных событий (внутренний биологический отрицательный контроль, рисунок 1E), рассматривается как vGLUT1-положительная фракция в образце. 2. Обнаружение поглощения in vitro сырых синаптосом микроглией Препарат сырых синаптосом, маркировка pHrodo RedПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги должны выполняться на льду.Выполните шаги с 1.1 по 1.2. Перенесите мозг в чашку Петри, наполненную 1 мл ледяной среды нервных клеток, и тщательно препарируйте гиппокамп. Всегда держите чашку Петри на льду. Используйте гиппокамп для выделения микроглии на следующем этапе. Перенесите остальную часть мозга (за исключением мозжечка и обонятельной луковицы) в гомогенизатор Dounce, наполненный 1 мл реагента для экстракции синаптического белка, и аккуратно диссоциируйте ткань с помощью рыхлого пестика примерно ~30 ударами. Дополните одну таблетку ингибитора протеазы на 10 мл экстракционного реагента и изолируйте синаптосомы в соответствии с инструкциями производителя.Реагенты для экстракции синаптических белков, такие как SynPER19, используются для получения синаптосом, содержащих биологически активные пре- и постсинаптические белки. Растворите неочищенную гранулу синаптосомы в 500 мкл 0,1 М Na2раствора CO3 . Окрасьте образец синаптосомы 10 мкл 0,2 мМ pHrodo Red. Образцы сырых синаптосом инкубировать при комнатной температуре (24-25 °C) в течение 1,5 ч с легким перемешиванием. Добавьте в образец 1 мл холодного DPBS, центрифугируйте в течение 1 мин на полной скорости (20,815 × г) и аспирируйте надосадочную жидкость. Повторите шаг 2.1.5 в общей сложности 7 раз, чтобы удалить несвязанное избыток pHrodo Red из образцов. После последней центрифуги проведите стандартный анализ BCA для количественного определения концентраций белка в образце. Опционально: замораживание образцов синаптосомы в DPBS с 5% ДМСО с использованием жидкого азота и их хранение в течение 3 недель при -80 °C. Накройте трубки алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму воздействие света. In vitro Грубый анализ поглощения синаптосомами с использованием свежевыделенной микроглии взрослого человекаПриготовьте аCSF и уравновесьте его с 95% O2:5% CO2 в течение 30 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения шагов 2.2.2-2.2.4 следуйте инструкциям производителя по приготовлению раствора для варки на основе папаина. Добавьте 4 мл аКСФ во флакон 2 в папаине. Поместите флакон на водяную баню при температуре 37 °C на ~10 минут, пока раствор папаина не станет прозрачным. Добавьте 400 μL aCSF во флакон 3 в наборе папаина. Осторожно перемешайте ~10 раз медленным пипетированием. Добавьте 200 мкл из флакона 3 во флакон 2 (восстановлено на шаге 2.2.3). Сохраните оставшуюся часть флакона 3. Возьмите рассеченный гиппокамп на шаге 2.1.2 и измельчите рассеченный гиппокамп с помощью скальпеля. Переложите измельченный гиппокамп в тканевую диссоциаторную трубку, заполненную 2 мл ферментного раствора, приготовленного на шаге 2.2.5. Поместите трубку в диссоциатор тканей и запустите программу: 37C_ABDK_01 (занимает ~30 минут). Поместите образцы на водяную баню при температуре 37 °C на ~20 минут и растирайте смесь каждые 5 минут с помощью пипетки объемом 1 мл без образования пузырьков.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс следует продолжать до тех пор, пока ткань полностью не диссоциирует и не станет полностью однородной, чтобы обеспечить эффективную диссоциацию. Все последующие этапы центрифугирования проводят при температуре 4 °С, если не указано иное. Осторожно удалите помутневшую клеточную суспензию в новую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 мин. В течение этого 5-минутного периода приготовьте следующую смесь для промывки (5 мл) на образец; добавить 500 мкл восстановленного раствора альбумин-овомукоидного ингибитора, входящего в состав папаина, в 4,5 мл аКСФ. Добавьте оставшийся раствор во флаконе 3 с шага 2.2.5 в промывочную смесь. Выбросьте надосадочную жидкость с шага 2.2.8 и немедленно повторно суспендируйте клеточную гранулу в растворе промывочной смеси. Пропустите образец через фильтр 70 μм в новую микроцентрифужную пробирку объемом 5 мл. Центрифугируйте образцы при давлении 300 × г в течение 5 минут. Перейдите к этапу градиентного центрифугирования по методу Перколла, описанному ранее в шагах 1.7-1.9. Осторожно ресуспендируйте клетки в буфере для окрашивания MACS, медленно пипетируя вверх и вниз. Инкубируйте образцы в течение 15 минут при 4 °C. Добавьте 1 мл буфера MACS в каждый образец и центрифугируйте при давлении 300 × г в течение 8 минут. Ресуспендируйте элементы в 500 мкл буфера MACS. Поместите столбцы положительного отбора в магнитный сепаратор. Уравновесьте столбцы, промыв их 3 мл буфера MACS. Аккуратно перемешайте и нанесите 500 μл клеточной суспензии на колонку. Промойте колонки 3 раза 3 мл буфера MACS. Снимите колонки с магнитного сепаратора и поместите их на конические пробирки объемом 15 мл. Добавьте 5 мл буфера MACS в колонку и сразу же промойте ячейки с помощью пуховика. Центрифугируйте образцы при 300 × г в течение 10 минут. За этот период приготовьте 20 мл 40% FBS в DPBS. Разогрейте 1 мл DMEM на образец до 37 °C на водяной бане. Растворите конечную клеточную гранулу в 1 мл предварительно подогретого DMEM. Засейте около ~150 000-200 000 клеток в 500 мкл предварительно подогретого DMEM на лунку в 24-луночном планшете. В качестве контроля засейте аналогичное количество клеток в 1-2 дополнительные лунки. Проверьте слияние клеток во всех лунках с помощью светового микроскопа.Примечание: Если целевой областью мозга является гиппокамп или сравнительно небольшие области мозга, можно объединить 5 мышей на образец (n), чтобы выделить ~150 000 микроглии. Для всего мозга 1 мыши на n будет достаточно, чтобы получить одинаковое количество клеток с использованием обоих протоколов выделения. В качестве альтернативы, ~40 000 ячеек могут быть помещены в 96-луночные планшеты с конечным объемом 100 мкл для начала анализа поглощения. Это уменьшает количество анализируемых клеток, но также уменьшает количество мышей, используемых на n. Белковая депривация из-за отсутствия FCS в DMEM спровоцирует фагоцитоз. Инкубируйте планшет в течение 1-2 ч в инкубаторе (37 °C и 5%CO2).Примечание: Этот шаг направлен на то, чтобы клетки восстановились от подверженных стрессу эффектов процедуры изоляции до начала анализа функционального поглощения. Очень медленно выньте 250 μL среды из каждой лунки, добавьте 250 μL свежей предварительно подогретой DMEM в каждую лунку и добавьте 3 μг синаптосом, меченных красным цветом pHRodo сверху. Проверьте слитность клеток во всех лунках с помощью светового микроскопа.Для отрицательных контрольных лунок добавьте такое же количество немеченых синаптосом в дополнительную лунку, засеянную клетками. Для тестовых лунок убедитесь, что лунка 1 содержит только ячейки; well 2 содержит клетки+ немеченые синаптосомы; well-3 содержит клетки+ 3 мкг pHrodo Red; лунка 4 содержит DMEM + 3 μг pHrodo Red. Инкубируйте клетки с синаптосомами в течение 2 ч в инкубаторе (37 °C и 5%CO2). Выньте среду и промойте лунки холодной ДПБС. Добавьте 200 мкл раствора трипсина/ЭДТА в лунку, чтобы отсоединить клетки на 35 с. Добавьте 1 мл 40% FBS в DPBS на лунку и перенесите элементы в полипропиленовую пробирку объемом 5 мл через сетчатое фильтр. Во время этого процесса держите пластину и трубку на льду, чтобы облегчить отслоение клеток. Промойте каждую лунку 2 раза, используя 500 μл ледяного DPBS. Собранные образцы центрифугируют при 500 × г в течение 5 мин. Ресуспендировать клетки в окрашивающем растворе, содержащем 1/200 CD16/CD32 в 100 мкл буфера FACS, и инкубировать в течение 10 мин на льду. После инкубации добавьте в окрашивающий раствор CD11b и CD45 с конечной концентрацией 1/100 от каждого. Инкубируйте образцы в течение 20 минут при температуре 4 °C в темноте. Промойте образцы 1 мл буфера FACS и центрифугируйте их при 300 × г в течение 10 минут. Ресуспендируйте гранулу в 250 мкл буфера FACS и зарегистрируйте не менее 100 000 событий с помощью проточной цитометрии. Анализируйте интенсивность флуоресценции pHrodo Red из микроглии CD11b++/CD45+ . Стратегия стробирования (Рисунок 2C)Отрегулируйте первичный вентиль: Forward Scatter Area (FSC-A) [ось x] и Side Scatter Area (SSC-A) [ось x], чтобы включить популяцию микроглии в зону ворот и исключить клеточный мусор. Отрегулируйте область прямого рассеяния (FSC-A) [ось x] и высоту прямого рассеивания (FSC-H) [ось y], чтобы исключить дублеты. Синглеты отображаются в виде диагонали на этой точечной диаграмме. Отрегулируйте CD11b-PECy7 [ось y] и CD45-APC [ось x] и затворите популяцию с высоким поверхностным уровнем CD11b и средним уровнем CD45 в виде микроглии. Рассчитайте медианную интенсивность флуоресценции pHrodo-PE из этой популяции. Используйте те же клетки, инкубированные с немечеными синаптосомами, в качестве отрицательного контроля.