Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

En la Figura 1A se ilustra gráficamente una visión general del procedimiento experimental. Todos los experimentos relacionados con el manejo de animales vivos utilizados se realizaron en estricta conformidad con la Ley de Protección Animal alemana y fueron aprobados por la Oficina Regional de Salud y Servicios Sociales en Berlín (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín, Alemania). Los ratones fueron alojados en grupos en jaulas ventiladas en condiciones estándar de laboratorio con un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h en las instalaciones del núcleo animal del Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (MDC). Se proporcionaba comida y agua ad libitum. Consulte la Tabla 1 para la composición de tampones y reactivos y la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los reactivos, instrumentos y materiales utilizados en este protocolo. Para el ensayo específico de vGLUT1, utilizamos el término in vivo* en todo el manuscrito para reconocer que la citometría de flujo requiere homogeneización de tejidos y aislamiento celular, y la microglía exhibe aproximadamente un 95% de viabilidad después del procedimiento de aislamiento (Figura 1B y Figura Suplementaria S1). Por lo tanto, conservan su capacidad de engullir material sináptico ex vivo, durante un corto período, hasta la fijación. Por lo tanto, la cuantificación de la microglía vGLUT1+ comprende tanto el envolvimiento in vivo como el ex vivo a corto plazo hasta la etapa de fijación. 1. Tinción intracelular de vGLUT1 para la detección de envolvimiento in vivo* de sinapsis glutamatérgicas por microglía NOTA: El siguiente procedimiento de aislamiento celular es una adaptación del16. Todos los pasos del aislamiento celular deben llevarse a cabo en hielo. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital. Perfundir los ratones por vía intracardíaca con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco helada durante ~2 min.NOTA: Se utiliza un ratón por muestra (n). Saca el cerebro del cráneo y consérvalo en 1 mL de medio de células neurales.NOTA: El medio celular neural, como el medio Hibernate-A, se utiliza para garantizar una alta viabilidad de las células después del proceso de disociación del tejido. Transfiera el cerebro a una placa de Petri llena de 1 mL de medio de células neurales heladas y diseccione los hipocampos como sedescribió anteriormente. Transfiera los hipocampos a un homogeneizador Dounce lleno de 1 mL de medio de células neurales y disocie el tejido con el mortero suelto con aproximadamente ~ 25 movimientos suaves. Coloque un colador de 70 μm en un tubo de polipropileno de 5 mL y agregue 500 μL de medio de célula neural. Transfiera el homogeneizado de tejido al tubo de polipropileno de 5 mL a través del colador. Enjuague el homogeneizador Dounce 2 veces con 1 mL de medio de células neurales frías y centrifugue las muestras a 400 × g durante 8 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de DPBS helado mediante un pipeteo suave. Asegure una suspensión homogénea y complete el volumen final a 1,5 mL mediante el uso de DPBS. Añadir 500 μL de solución isotónica de Percoll a la muestra, resuspenderla suavemente y recubrirla con otros 2 ml de DPBS frío. Centrifugar las muestras a 3.000 × g durante 10 minutos con aceleración máxima y sin freno. Aspire la capa superior, así como el disco de mielina en la fase media.NOTA: Todos los siguientes pasos de centrifugación se llevan a cabo a 4 oC si no se especifica lo contrario. Añadir 4 mL de DPBS frío y centrifugar las muestras a 400 × g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μL de solución de tinción de viabilidad fijable e incubar las muestras durante 30 min a 4 °C. Añada 1 ml de DPBS frío a la muestra y centrifugue las muestras a 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y añada 100 μL de solución de tinción CD16/CD32 (1/200 en tampón FACS). Vórtice durante ~5 s e incube durante 10 min a 4 °C.NOTA: La tinción con CD16/CD32 es un tratamiento previo para minimizar la unión inespecífica de los anticuerpos a las células portadoras de FcR, como la microglía, antes de aplicaciones como la citometría de flujo. Añada 1 ml de tampón FACS a la muestra y centrifugue a 300 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 100 μL de tinción master mix-I (1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G en 1x FACS Buffer). Incubar las muestras durante 20 min a 4°C en la oscuridad. Añada 1 ml de tampón FACS a la muestra y centrifugue a 300 × g durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet en 250 μL de tampón de fijación. Incubar a 4 °C durante 25 min. Añadir 2 mL de tampón de permeabilización 1x (PERM) y centrifugar 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y añada 100 μL de vGLUT1 o de solución de tinción de control de isotipo. Agitar el vórtice durante ~5 s e incubar las muestras a 4 °C durante 50 min. Añadir 2 mL de 1x PERM Buffer y centrifugar 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y añada 2 mL de tampón FACS a las muestras. Centrifugar a 300 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 250 μL de tampón FACS y pase las muestras a través de un filtro filtrante de 40 μm. Analice la intensidad de fluorescencia de vGLUT1 a partir de microglía única/viable/CD11b++/CD45+ mediante citometría de flujo. Utilice los macrófagos del bazo como control negativo para cada experimento.Aísle los esplenocitos comprimiendo suavemente el tejido picado del bazo a través de un filtro de filtro de 70 μm dos veces. Enjuague los filtros con 40 mL de DPBS y recoja la suspensión en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar 350 × g durante 10 min y resuspender el pellet resultante en una solución de 1 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos. Incubar durante 10 min en hielo. Añadir 10 mL de DPBS a la muestra después de la incubación y centrifugar a 350 × g durante 10 min. Continúe con los pasos de tinción explicados entre los pasos 1.11 y 1.17.NOTA: La estrategia de compuerta se proporciona en la Figura Suplementaria S2 para definir los macrófagos del bazo como CD11b ++/ CD45 ++/ Población de células viables. Estrategia de compuerta (Figura 1)Puerta primaria: Ajuste el área de dispersión frontal (FSC-A) [eje x] y el área de dispersión lateral (SSC-A) [eje y] para incluir la población de microglía en el área cerrada y excluir los desechos celulares. Ajuste el área de dispersión directa (FSC-A) [eje x] y la altura de dispersión directa (FSC-H) [eje y] para excluir dobletes. Los singletes aparecen como una diagonal en este diagrama de puntos. Ajuste CD11b-PECy7 [eje y] y CD45-APC [eje x] y dirija la población con un alto nivel superficial de CD11b y un nivel medio de CD45 como microglía. Excluya las células muertas en la puerta negativa FITC[eje Y]. OPCIONAL: Excluya también las células que son positivas para Ly6C- y Ly6G-FITC en la puerta negativa de FITC para excluir los macrófagos asociados al SNC del análisis.NOTA: A diferencia de las células vivas, las células muertas con membranas comprometidas permiten que el tinte de viabilidad fijable ingrese al citoplasma, lo que aumenta la cantidad de marcaje de proteínas18. Por lo tanto, las células muertas serán más brillantes que las células vivas, que se incluyen en la puerta definida. Ajuste CD45-APC [eje x] y vGLUT1-PE [eje y]; la población que está por encima de la puerta umbral, donde no se detectan eventos positivos en la muestra de bazo (control biológico negativo interno, Figura 1E) se considera la fracción positiva para vGLUT1 en la muestra. 2. Detección de engullimiento in vitro de sinaptosomas crudos por microglía Preparación cruda de sinaptosomas y etiquetado de pHrodo RedNOTA: Todos los siguientes pasos deben realizarse con hielo.Siga los pasos 1.1 a 1.2. Transfiera el cerebro a una placa de Petri llena de 1 ml de medio de células neurales heladas y diseccione cuidadosamente los hipocampos. Mantenga siempre la placa de Petri en hielo. Utilice el hipocampo para el aislamiento de la microglía en el siguiente paso. Transfiera el resto del cerebro (excluyendo el cerebelo y el bulbo olfatorio) a un homogeneizador Dounce lleno de 1 mL de reactivo de extracción de proteínas sinápticas y disocie suavemente el tejido usando el mortero suelto con aproximadamente ~ 30 golpes. Complemente el inhibidor de la proteasa en comprimido por cada 10 ml del reactivo de extracción y aísle los sinaptosomas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.NOTA: Los reactivos de extracción sináptica de proteínas, como SynPER19, se utilizan para preparar sinaptosomas que contienen proteínas presinápticas y postsinápticas biológicamente activas. Disolver el pellet crudo de sinaptosoma en 500 μL de solución de 0,1 M de Na2CO3 . Teñir la muestra de sinaptosomas con 10 μL de 0,2 mM de pHrodo Red. Incubar las muestras brutas de sinaptosomas a temperatura ambiente (24-25 °C) durante 1,5 h con agitación suave. Añadir 1 mL de DPBS frío a la muestra, centrifugar durante 1 min a máxima velocidad (20.815 × g) y aspirar el sobrenadante. Repita el paso 2.1.5 durante 7 veces en total para eliminar el exceso de pHrodo Red no unido de las muestras. Después de la última centrífuga, realice un ensayo estándar de BCA para cuantificar las concentraciones de proteínas de la muestra. Opcional: congelar muestras de sinaptosomas en DPBS con un 5% de DMSO utilizando nitrógeno líquido y conservarlas durante 3 semanas a -80 °C. Cubra los tubos con papel de aluminio para mantener la exposición a la luz al mínimo. In vitro Ensayo de envolvimiento de sinaptosomas crudos utilizando microglía adulta recién aisladaPrepare un CSF y equilibre con 95% O2:5%CO2 durante 30 min.NOTA: Para los pasos 2.2.2-2.2.4, siga las instrucciones del fabricante para la preparación de la solución de digestión a base de papaína. Agregue 4 mL de aCSF al vial 2 del kit de papaína. Coloque el vial en un baño de agua a 37 °C durante ~10 min hasta que la solución de papaína parezca clara. Añadir 400 μL de aCSF al vial 3 del kit de papaína. Mezcle suavemente durante ~ 10 veces mediante un pipeteo lento. Añadir 200 μL del vial 3 al vial 2 (reconstruido en el paso 2.2.3). Guarde el resto del vial 3. Tome los hipocampos disecados en el paso 2.1.2 y pique los hipocampos disecados con un bisturí. Transfiera el hipocampo picado a un tubo disociador de tejido lleno de 2 mL de solución enzimática preparada en el paso 2.2.5. Coloque el tubo en el disociador de tejidos y ejecute el programa: 37C_ABDK_01 (tarda ~30 min). Colocar las muestras en un baño de agua a 37 °C durante ~20 min y triturar la mezcla cada 5 min con una pipeta de 1 mL sin hacer burbujas.NOTA: Este proceso debe continuarse hasta que el tejido esté completamente disociado y parezca completamente homogéneo para asegurar una disociación eficiente. Todos los siguientes pasos de centrifugación se llevan a cabo a 4 oC si no se especifica lo contrario. Retire con cuidado la suspensión de células turbias a un nuevo tubo de 15 ml y centrifugue a 300 × g durante 5 minutos. Durante este período de 5 minutos, prepare la siguiente mezcla de lavado (5 ml) por muestra; añadir 500 μL de la solución de inhibidor de la albúmina-ovomucoide reconstituida suministrada en el kit de papaína a 4,5 mL de LCR-a. Añada la solución restante en el vial 3 del paso 2.2.5 a la mezcla de lavado. Deseche el sobrenadante del paso 2.2.8 y vuelva a suspender inmediatamente el pellet celular en la solución de mezcla de lavado. Pase la muestra a través de un filtro de 70 μm a un nuevo tubo de microcentrífuga de 5 mL. Centrifugar las muestras a 300 × g durante 5 min. Continúe con el paso de centrifugación en gradiente de Percoll explicado anteriormente en los pasos 1.7-1.9. Vuelva a suspender las células con cuidado en el tampón de tinción MACS pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. Incubar las muestras durante 15 min a 4 °C. Añada 1 ml de tampón MACS a cada muestra y centrifugar a 300 × g durante 8 min. Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón MACS. Coloque las columnas de selección positiva en el separador magnético. Equilibre las columnas enjuagándolas con 3 mL de MACS Buffer. Mezclar suavemente y aplicar 500 μL de la suspensión celular sobre la columna. Lave las columnas 3 veces con 3 mL de MACS Buffer. Retire las columnas del separador magnético y colóquelas en tubos cónicos de 15 mL. Añada 5 ml de tampón MACS a la columna y enjuague inmediatamente las células con un rellenador. Centrifugar las muestras a 300 × g durante 10 min. Durante este período, prepare 20 mL de 40% de FBS en DPBS. Precalentar 1 mL de DMEM por muestra hasta 37 °C en un baño de agua. Disuelva el pellet de celda final en 1 mL de DMEM precalentado. Siembre alrededor de ~ 150,000-200,000 células en 500 μL de DMEM precalentado por pocillo en una placa de 24 pocillos. Como control, siembre un número similar de células en 1-2 pocillos adicionales. Compruebe la confluencia de células en todos los pocillos utilizando un microscopio óptico.NOTA: Si la región cerebral objetivo es el hipocampo o regiones cerebrales comparativamente pequeñas, se pueden agrupar 5 ratones por muestra (n) para aislar ~ 150,000 microglías. Para todo el cerebro, 1 ratón por n será suficiente para obtener un número similar de células utilizando ambos protocolos de aislamiento. Alternativamente, se pueden sembrar ~ 40,000 células en placas de 96 pocillos en un volumen final de 100 μL para comenzar el ensayo de envolvimiento. Esto reduce el número de células analizadas, pero también reduce el número de ratones utilizados por n. La privación de proteínas debido a la falta de FCS en DMEM desencadenará la fagocitosis. Incubar la placa durante 1-2 h en la incubadora (37 °C y 5% de CO2).NOTA: Este paso tiene como objetivo que las células se recuperen de los efectos propensos al estrés del procedimiento de aislamiento antes del inicio del ensayo de envolvimiento funcional. Tome 250 μL de medio de cada pocillo muy lentamente, agregue 250 μL de DMEM fresco precalentado a cada pocillo y agregue 3 μg de sinaptosomas marcados con pHRodo Red en la parte superior. Comprobar la confluencia celular en todos los pocillos utilizando un microscopio óptico.Para los pocillos de control negativos, agregue la misma cantidad de sinaptosomas sin marcar al pozo extra sembrado con células. En el caso de los pozos de prueba, asegúrese de que el pocillo 1 contenga solo células; el pozo 2 contiene células+ sinaptosomas sin marcar; well-3 contiene células+ 3 μg de pHrodo Red; el pozo 4 contiene DMEM + 3 μg de pHrodo Red. Incubar las células con sinaptosomas durante 2 h en la incubadora (37 °C y 5% de CO2). Saque el medio y lave los pocillos con DPBS frío. Añadir 200 μL de solución de tripsina/EDTA por pocillo para separar las células durante 35 s. Agregue 1 mL de 40% de FBS en DPBS por pocillo y transfiera las celdas a un tubo de polipropileno de 5 mL a través del colador. Mantenga tanto la placa como el tubo en hielo durante este proceso para facilitar el desprendimiento de las células. Lave cada pocillo 2 veces con 500 μL de DPBS helado. Centrifugar las muestras recogidas a 500 × g durante 5 min. Vuelva a suspender las células en la solución de tinción que contiene 1/200 CD16/CD32 en 100 μL de tampón FACS e incube durante 10 min en hielo. Después de la incubación, agregue CD11b y CD45 a la solución de tinción con una concentración final de 1/100 de cada uno. Incubar las muestras durante 20 min a 4 °C en la oscuridad. Lavar las muestras con 1 mL de tampón FACS y centrifugarlas a 300 × g durante 10 min. Vuelva a suspender el pellet en 250 μL de tampón FACS y registre al menos 100.000 eventos totales mediante citometría de flujo. Analice la intensidad de fluorescencia roja de pHrodo de la microglía CD11b++/CD45+ . Estrategia de compuerta (Figura 2C)Ajuste la puerta primaria: Área de dispersión directa (FSC-A) [eje x] y Área de dispersión lateral (SSC-A) [eje x] para incluir la población de microglía en el área cerrada y excluir los desechos celulares. Ajuste el área de dispersión directa (FSC-A) [eje x] y la altura de dispersión directa (FSC-H) [eje y] para excluir dobletes. Los singletes aparecen como una diagonal en este diagrama de puntos. Ajuste CD11b-PECy7 [eje y] y CD45-APC [eje x] y controle la población con un nivel de superficie alto de CD11b y un nivel medio de CD45 como microglía. Calcular la mediana de la intensidad de fluorescencia de pHrodo-PE a partir de esta población. Utilice las mismas células incubadas con sinaptosomas no marcados como control negativo.