使用流式细胞术定量突触材料的小胶质细胞吞噬

实验程序的一般视图如图 1A 所示。所有涉及处理所用活体动物的实验均严格按照德国动物保护法进行，并已获得柏林地区卫生和社会服务办公室 （Landesamt für Gesundheit und Soziales， Berlin， Germany） 的批准。小鼠在标准实验室条件下分组饲养在通风笼中，在 Max Delbrück 分子医学中心 （MDC） 的动物核心设施中进行 12：12 小时的光照/黑暗循环。随意提供食物和水 。 缓冲液和试剂的组成见 表 1 ，与本协议中使用的所有试剂、仪器和材料相关的详细信息见 材料表 。对于 vGLUT1 特异性测定，我们在整个手稿中使用了术语 体内*，以承认流式细胞术需要组织匀浆和细胞分离，并且小胶质细胞在分离程序后表现出大约 95% 的活力（图 1B 和 补充图 S1）。因此，它们在短时间内保留了 在体外吞噬突触材料的能力，直到固定。因此，vGLUT1 + 小胶质细胞的定量包括 体内 和短期 离体 吞噬，直到固定步骤。 1. 细胞内 vGLUT1 染色检测小胶质细胞体内 * 吞噬谷氨酸能突触 注：以下细胞分离程序改编自16.细胞分离的所有步骤都应在冰上进行。 使用腹膜内注射戊巴比妥麻醉小鼠。用 10 mL 冰冷的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 心内灌注小鼠 ~2 分钟。注意：每个样品 （n） 使用一只鼠标。 将大脑从颅骨中取出，并将其保存在 1 mL 神经细胞培养基中。注：神经细胞培养基，如 Hibernate-A 培养基，用于确保组织解离过程后细胞的高活力。 将大脑转移到装有 1 mL 冰冷神经细胞培养基的培养皿中，并如前所述解剖海马体17。 将海马体转移到装有 1 mL 神经细胞培养基的 Dounce 匀浆器中，并使用松散的杵以大约 ~25 次轻柔的笔触分离组织。 将 70 μm 过滤器放在 5 mL 聚丙烯管上，并添加 500 μL 神经细胞培养基。通过过滤器将组织匀浆转移到 5 mL 聚丙烯管中。 用 1 mL 冷神经细胞培养基冲洗 Dounce 匀浆器 2 次，并以 400 × g 离心样品 8 分钟。 吸出上清液，并通过轻轻移液将沉淀重悬于 500 μL 冰冷的 DPBS 中。确保悬浮液均匀，并使用 DPBS 完成最终体积至 1.5 mL。 向样品中加入 500 μL 等渗 Percoll 溶液，轻轻重悬，然后用另外 2 ml 冷 DPBS 覆盖。 将样品以 3,000 × g 离心 10 分钟，全加速，无制动。吸出中间阶段的顶层和髓鞘盘。注意：如果没有特别说明，以下所有离心步骤均在 4 °C 下进行。 加入 4 mL 冷 DPBS，并以 400 × g 离心样品 10 分钟。吸出上清液，将细胞重悬于 100 μL 可固定活力染色溶液中，并将样品在 4 °C 下孵育 30 分钟。 向样品中加入 1 mL 冷 DPBS，并以 300 × g 离心样品 5 分钟。弃去上清液，加入 100 μL CD16/CD32 染色液（FACS 缓冲液中的 1/200）。涡旋 ~5 秒，并在 4 °C 下孵育 10 分钟。注：CD16/CD32 染色是一种预处理，用于在流式细胞术等应用之前最大限度地减少抗体与携带 FcR 的细胞（如小胶质细胞）的非特异性结合。 向样品中加入 1 mL FACS 缓冲液，并以 300 × g 离心 5 分钟。吸出上清液并加入 100 μL 染色预混液-I（1/100 抗 CD11b/抗 CD45 + 1/200 抗 Ly6C/抗 Ly6G，溶于 1x FACS 缓冲液中）。将样品在 4°C 下避光孵育 20 分钟。 向样品中加入 1 mL FACS 缓冲液，并以 300 × g 离心 5 分钟。 将沉淀重悬于 250 μL 固定缓冲液中。在 4 °C 下孵育 25 分钟。 加入 2 mL 1x 透化 （PERM） 缓冲液，并以 300 × g 离心 5 分钟。 弃去上清液，加入 100 μL vGLUT1 或同种型对照染色液。涡旋 ~5 秒，并将样品在 4 °C 下孵育 50 分钟。 加入 2 mL 的 1x PERM 缓冲液，并以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，向样品中加入 2 mL FACS 缓冲液。 以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 250 μL FACS 缓冲液中，并将样品通过 40 μm 过滤器过滤器。 使用流式细胞术分析来自单个/活/CD11b++/CD45 + 小胶质细胞的 vGLUT1 荧光强度。使用脾巨噬细胞作为每个实验的阴性对照。通过 70 μm 过滤器过滤器轻轻压缩碎脾组织两次来分离脾细胞。用 40 mL DPBS 冲洗过滤器，并将悬浮液收集在 50 mL 锥形管中。 离心 350 × g 10 分钟，然后将所得沉淀重悬于 1 mL 红细胞裂解缓冲液溶液中。在冰上孵育 10 分钟。 孵育后向样品中加入 10 mL DPBS，并以 350 × g 离心 10 分钟。 继续执行步骤 1.11 和 1.17 之间解释的染色步骤。注意： 补充图 S2 中提供了门控策略，用于将脾巨噬细胞定义为 CD11b ++/ CD45 ++/ 活细胞群。 门控策略（图 1）主门：调整前向散射区 （FSC-A） [x 轴] 和侧向散射区 （SSC-A） [y 轴] 以将小胶质细胞群包含在门控区域并排除细胞碎片。 调整前向散射区域 （FSC-A） [x 轴] 和前向散射高度 （FSC-H） [y 轴] 以排除双峰。单峰在此点图上显示为对角线。 调整 CD11b-PECy7 [y 轴] 和 CD45-APC [x 轴]，并将具有高表面水平的 CD11b 和中等水平 CD45 的群体设门为小胶质细胞。 排除 FITC[y 轴] 负门中的死细胞。可选：还要排除 FITC 阴性门中 Ly6C 和 Ly6G-FITC 阳性的细胞，以从分析中排除 CNS 相关巨噬细胞。注：与活细胞相比，膜受损的死细胞允许可固定的活性染料进入细胞质，从而增加蛋白质标记的量18。因此，死细胞将比活细胞更亮，活细胞包含在定义的门中。 调整 CD45-APC [x 轴] 和 vGLUT1-PE [y 轴];高于阈值门的群体，在脾脏样本中未检测到阳性事件（内部生物阴性对照， 图 1E）被视为样本中的 vGLUT1 阳性部分。 2. 小胶质细胞体外吞噬粗突触体 粗突触体制备和 pHrodo Red 标记注意：以下所有步骤都应在冰上进行。按照步骤 1.1 到 1.2 进行操作。 将大脑转移到装有 1 mL 冰冷神经细胞培养基的培养皿中，并仔细解剖海马体。始终将培养皿放在冰上。下一步使用海马体进行小胶质细胞分离。 将大脑的其余部分（不包括小脑和嗅球）转移到装有 1 mL 突触蛋白提取试剂的 Dounce 匀浆器中，并使用松散的研杵轻轻解离组织，敲击大约 ~30 次。每 10 mL 提取试剂补充一片蛋白酶抑制剂，并根据制造商的说明分离突触体。注：突触蛋白提取试剂，如 SynPER19，用于制备含有生物活性突触前和突触后蛋白的突触体。 将粗突触体沉淀溶解在 500 μL 的 0.1 M Na2CO3 溶液中。用 10 μL 0.2 mM pHrodo Red 对突触体样品进行染色。将粗突触体样品在室温 （24-25 °C） 下孵育 1.5 小时，同时轻轻搅拌。 向样品中加入 1 mL 冷 DPBS，全速离心 1 分钟 （20,815 × g），然后吸出上清液。 重复步骤 2.1.5 总共 7 次，以从样品中去除未结合的过量 pHrodo Red。 在最后一次离心后，进行标准 BCA 分析以定量样品的蛋白质浓度。 可选：使用液氮在含有 5% DMSO 的 DPBS 中快速冷冻突触体样品，并在 -80 °C 下保存 3 周。 用铝箔覆盖管子，以保持光线暴露最少。 In vitro 使用新鲜分离的成体小胶质细胞的粗突触体吞噬测定制备 aCSF 并用 95% O2：5%CO2 平衡 30 分钟。注：对于步骤 2.2.2-2.2.4，请按照制造商的说明制备木瓜蛋白酶消化液。 将 4 mL aCSF 添加到木瓜蛋白酶试剂盒中的 小瓶 2 中。将样品瓶置于 37 °C 水浴中 ~10 分钟，直到木瓜蛋白酶溶液呈澄清状态。 将 400 μL aCSF 添加到木瓜蛋白酶试剂盒中的 小瓶 3 中。通过缓慢移液轻轻混合 ~10 次。 从 样品瓶 3 向 样品瓶 2 中加入 200 μL（在步骤 2.2.3 中重建）。保存 小瓶 3 的其余部分。 取步骤 2.1.2 中解剖的海马体，用手术刀将解剖的海马体切碎。 将切碎的海马体转移到装有 2 mL 步骤 2.2.5 中制备的酶溶液的组织解离管中。将试管放入组织解离器中并运行程序： 37C_ABDK_01 （需要 ~30 分钟）。 将样品置于 37 °C 的水浴中 ~20 分钟，并使用 1 mL 移液管每 5 分钟研磨一次混合物，不要产生任何气泡。注意：这个过程应该继续进行，直到组织完全解离并且看起来完全均匀，以确保有效的解离。如果未另有说明，则以下所有离心步骤均在 4 °C 下进行。 小心地将混浊的细胞悬液去除到新的 15 mL 试管中，并以 300 × g 离心 5 分钟。 在这 5 分钟内，每个样品制备以下洗涤混合物 （5 mL）;将木瓜蛋白酶试剂盒中提供的 500 μL 重组白蛋白-卵类粘蛋白抑制剂溶液添加到 4.5 mL aCSF 中。将步骤 2.2.5 中小瓶 3 中的剩余溶液添加到洗涤混合物中。 丢弃步骤 2.2.8 中的上清液，并立即将细胞沉淀重悬于洗涤混合物溶液中。 将样品通过 70 μm 过滤器进入新的 5 mL 微量离心管。将样品以 300 × g 离心 5 分钟。 继续执行前面在步骤 1.7-1.9 中解释的 Percoll 梯度离心步骤。 通过缓慢上下移液，在 MACS 染色缓冲液中小心地重悬细胞。将样品在 4 °C 下孵育 15 分钟。 向每个样品中加入 1 mL MACS 缓冲液，并以 300 × g 离心 8 分钟。 将细胞重悬于 500 μL 的 MACS 缓冲液中。 将正数选择列放入磁性分离器中。用 3 mL MACS 缓冲液冲洗柱子来平衡柱子。 轻轻混合并将 500 μL 细胞悬液涂在色谱柱上。用 3 mL MACS 缓冲液洗涤色谱柱 3 次。 从磁性分离器中取出色谱柱，并将其放在 15 mL 锥形管上。在色谱柱上加入 5 mL MACS 缓冲液，并立即使用溶出器冲洗细胞。将样品以 300 × g 离心 10 分钟。 在此期间，在 DPBS 中制备 20 mL 的 40% FBS。在水浴中将每个样品 1 mL DMEM 预热至 37 °C。 将最终细胞沉淀溶解在 1 mL 预热的 DMEM 中。在 24 孔板中，每孔 500 μL 预热的 DMEM 中接种约 ~150,000-200,000 个细胞。作为对照，在 1-2 个额外的孔中接种相似数量的细胞。使用光学显微镜检查所有孔中细胞的汇合度。注意：如果目标大脑区域是海马体或相对较小的大脑区域，则每个样品 （n） 可以合并 5 只小鼠以分离 ~150,000 个小胶质细胞。对于整个大脑，每 n 只小鼠 1 只就足以使用两种分离方案获得相似数量的细胞。或者，可以将 ~40,000 个细胞接种在最终体积为 100 μL 的 96 孔板中，以开始吞噬测定。这减少了分析的细胞数量，但也减少了每 n 使用的小鼠数量。由于 DMEM 中缺乏 FCS 而导致的蛋白质剥夺将触发吞噬作用。 将板在培养箱（37°C 和 5% CO2 ）中孵育 1-2 小时。注意：此步骤旨在使细胞在功能吞噬测定开始之前从分离程序的易受压力影响中恢复。 非常缓慢地从每个孔中取出 250 μL 培养基，向每个孔中加入 250 μL 新鲜预热的 DMEM，并在顶部添加 3 μg pHRodo Red 标记的突触体。使用光学显微镜检查所有孔中的细胞汇合度。对于阴性对照孔，将相同量的未标记突触体添加到接种有细胞的额外孔中。 对于测试孔，确保孔 1 仅包含细胞;孔 2 包含 Cells+ 未标记的突触体;孔-3 含有细胞 + 3 μg pHrodo Red;孔 4 含有 DMEM + 3 μg pHrodo Red。 将细胞与突触体在培养箱（37°C 和 5% CO2）中孵育 2 小时。 取出培养基并用冷 DPBS 清洗孔。每孔加入 200 μL 胰蛋白酶/EDTA 溶液以分离细胞 35 秒。 每孔加入 1 mL 40% FBS 的 DPBS 溶液，并通过过滤器将细胞转移到 5 mL 聚丙烯管中。在此过程中，将板和试管都放在冰上，以促进细胞分离。 使用 500 μL 冰冷的 DPBS 将每个孔洗涤 2 次。将收集的样品以 500 × g 离心 5 分钟。 将细胞重悬于含有 1/200 CD16/CD32 的染色溶液中，溶于 100 μL FACS 缓冲液中，并在冰上孵育 10 分钟。 孵育后，将 CD11b 和 CD45 加入染色溶液中，每种溶液的终浓度为 1/100。将样品在 4 °C 下避光孵育 20 分钟。 用 1 mL FACS 缓冲液洗涤样品，并以 300 × g 离心 10 分钟。 将沉淀重悬于 250 μL FACS 缓冲液中，并使用流式细胞术记录至少 100,000 个总事件。分析 CD11b++/CD45 + 小胶质细胞的 pHrodo Red 荧光强度。 门控策略（图 2C）调整主门：前向散射区 （FSC-A） [x 轴] 和侧向散射区 （SSC-A） [x 轴] 以将小胶质细胞群包含在门控区域并排除细胞碎片。 调整前向散射区域 （FSC-A） [x 轴] 和前向散射高度 （FSC-H） [y 轴] 以排除双峰。单峰在此点图上显示为对角线。 调整 CD11b-PECy7 [y 轴] 和 CD45-APC [x 轴]，并将具有高表面水平 CD11b 和中等水平 CD45 的群体设门为小胶质细胞。 计算来自该群体的 pHrodo-PE 的中位荧光强度。使用与未标记的突触体一起孵育的相同细胞作为阴性对照。