כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

מבט כללי על הליך הניסוי מומחש באופן גרפי באיור 1A. כל הניסויים הכרוכים בטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאמה קפדנית לחוק הגרמני להגנה על בעלי חיים ואושרו על ידי המשרד האזורי לבריאות ולשירותים חברתיים בברלין (Landesamt für Gesundheit und Soziales, ברלין, גרמניה). העכברים שוכנו בכלובים מאווררים בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם מחזור אור/חושך של 12:12 שעות במתקן ליבת בעלי החיים של מרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית (MDC). מזון ומים סופקו עד לליביטום. ראה טבלה 1 להרכב מאגרים וריאגנטים וטבלת החומרים לפרטים הקשורים לכל הריאגנטים, המכשירים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה. עבור הבדיקה הספציפית vGLUT1, השתמשנו במונח in vivo* לאורך כל כתב היד כדי להכיר בכך שציטומטריית זרימה דורשת הומוגניזציה של רקמות ובידוד תאים, ותאי מיקרוגליה מפגינים כ-95% כדאיות לאחר הליך הבידוד (איור 1B ואיור משלים S1). לכן, הם שומרים על יכולתם לבלוע חומר סינפטי ex vivo, לתקופה קצרה, עד הקיבוע. לפיכך, הכימות של מיקרוגליה vGLUT1+ כולל הן in vivo והן לטווח קצר ex vivo הבלעה עד לשלב הקיבוע. 1. צביעת vGLUT1 תוך תאית לזיהוי בליעה in vivo* של סינפסות גלוטמטרגיות על ידי מיקרוגליה הערה: הליך בידוד התאים הבא מותאם מ- 16. כל שלבי בידוד התאים צריכים להתבצע על קרח. להרדים את העכברים באמצעות הזרקה intraperitoneal של pentobarbital. יש לערבב את העכברים תוך לבדי עם 10 מ”ל של מלח חוצץ פוספט חוצץ (DPBS) קר כקרח של Dulbecco למשך ~2 דקות.הערה: עכבר אחד משמש לכל דגימה (n). הוציאו את המוח מהגולגולת ושמרו אותו ב-1 מ”ל של תווך תאי עצב.הערה: תווך תא עצבי, כגון מדיום Hibernate-A, משמש כדי להבטיח כדאיות גבוהה של תאים לאחר תהליך דיסוציאציה רקמתי. העבירו את המוח לצלוחית פטרי מלאה ב-1 מ”ל של תווך תאי עצב קרים כקרח ונתחו את ההיפוקמפוס כפי שתואר קודם לכן17. מעבירים את ההיפוקמפוס להומוגנייזר Dounce מלא ב-1 מ”ל של תווך תאי עצב ומנתקים את הרקמה באמצעות המזיק הרופף עם כ~25 משיכות עדינות. מניחים מסננת 70 מיקרומטר על צינור פוליפרופילן 5 מ”ל ומוסיפים 500 מיקרומטר של תווך תא עצבי. מעבירים את הרקמה הומוגנית לצינור הפוליפרופילן 5 מ”ל דרך המסננת. שטפו את ההומוגנייזר של Dounce 2x עם 1 מ”ל של תווך תא עצבי קר וצנטריפוגו את הדגימות ב 400 × גרם במשך 8 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של DPBS קר כקרח באמצעות פיפטינג עדין. ודא מתלה הומוגני והשלם את הנפח הסופי עד 1.5 מ”ל באמצעות DPBS. הוסף 500 μL של תמיסת פרקול איזוטונית לדגימה, השהה אותה מחדש בעדינות וצפה אותה בעוד 2 מ”ל של DPBS קר. צנטריפוגה הדגימות ב 3,000 × גרם במשך 10 דקות עם האצה מלאה וללא בלימה. שואפים את השכבה העליונה, כמו גם את דיסק המיאלין בשלב האמצעי.הערה: כל שלבי הצנטריפוגה הבאים מתבצעים ב- 4 oC אם לא צוין אחרת. הוסף 4 מ”ל של DPBS קר וצנטריפוגה את הדגימות ב 400 × גרם במשך 10 דקות. לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את התאים ב 100 μL של תמיסת צביעה קיימא לתיקון לדגור את הדגימות במשך 30 דקות ב 4 ° C. הוסף 1 מ”ל של DPBS קר לדגימה וצנטריפוגה את הדגימות ב 300 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה CD16/CD32 (1/200 במאגר FACS). מערבולת במשך ~ 5 שניות ודגרה במשך 10 דקות ב 4 ° C.הערה: צביעת CD16/CD32 היא טיפול מקדים למזעור קשירה לא ספציפית של נוגדנים לתאים נושאי FcR, כגון מיקרוגליה, לפני יישומים כגון ציטומטריית זרימה. הוסף 1 מ”ל של חיץ FACS לדגימה וצנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 100 μL של תערובת מאסטר צביעה-I (1/100 אנטי-CD11b/ אנטי-CD45 + 1/200 אנטי-Ly6C/ אנטי-Ly6G במאגר FACS אחד). דגרו על הדגימות במשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך. הוסף 1 מ”ל של חיץ FACS לדגימה וצנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 5 דקות. השהה מחדש את הגלולה ב 250 μL של חיץ קיבוע. יש לדגור ב-4°C למשך 25 דקות. הוסף 2 מ”ל של 1x permeabilization (PERM) חיץ וצנטריפוגה 300 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והוסיפו 100 μL של vGLUT1 או תמיסת צביעה של בקרת איזוטיפ. מערבול במשך ~ 5 שניות ולדגור את הדגימות ב 4 ° C במשך 50 דקות. הוסף 2 מ”ל של 1x PERM Buffer וצנטריפוגה 300 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והוסיפו 2 מ”ל של חיץ FACS לדגימות. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant. השהה מחדש את התאים במאגר FACS של 250 מיקרומטר והעבר את הדגימות דרך מסנן מסננת של 40 מיקרומטר. נתח את עוצמת הפלואורסצנטיות vGLUT1 ממיקרוגליה יחידה/בת קיימא/CD11b++/CD45+ באמצעות ציטומטריית זרימה. השתמשו במקרופאגים של הטחול כבקרה שלילית לכל ניסוי.בודד טחול על ידי דחיסה עדינה של רקמת טחול טחון דרך מסנן מסננת של 70 מיקרומטר פעמיים. שטפו את המסננים עם 40 מ”ל של DPBS ואספו את המתלה בצינור חרוטי של 50 מ”ל. צנטריפוגה 350 × גרם למשך 10 דקות ולהשעות מחדש את הגלולה המתקבלת בתמיסה של 1 מ”ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים. דוגרים במשך 10 דקות על קרח. הוסף 10 מ”ל של DPBS לדגימה לאחר הדגירה והצנטריפוגה ב 350 × גרם למשך 10 דקות. המשך בשלבי הצביעה המוסברים בין שלבים 1.11 ו- 1.17.הערה: אסטרטגיית ה-gating מוצגת באיור משלים S2 כדי להגדיר מקרופאגים של הטחול כ-CD11b ++/ CD45 ++/ אוכלוסיית תאים בת קיימא. אסטרטגיית Gating (איור 1)שער ראשי: התאם את אזור הפיזור הקדמי (FSC-A) [ציר x] ואת אזור הפיזור הצדדי (SSC-A) [ציר y] כך שיכלול את אוכלוסיית תאי המיקרוגליה באזור המגודר ולא יכלול את הפסולת התאית. התאם את אזור הפיזור קדימה (FSC-A) [ציר x] ואת גובה הפיזור קדימה (FSC-H) [ציר y] כדי לא לכלול כפילויות. סינגלים מופיעים באלכסון בתרשים נקודה זה. התאם CD11b-PECy7 [ציר y] ו- CD45-APC [ציר x] ושער את האוכלוסייה עם רמת שטח גבוהה של CD11b ורמה בינונית של CD45 כמיקרוגליה. אל תכלול תאים מתים בשער השלילי של ציר FITC[y]. אופציונלי: לא לכלול גם תאים חיוביים עבור Ly6C ו- Ly6G-FITC בשער FITC-שלילי כדי לא לכלול מקרופאגים הקשורים למערכת העצבים המרכזית מהניתוח.הערה: בניגוד לתאים חיים, תאים מתים עם קרומים פגומים מאפשרים לצבע הכדאיות הניתנת לתיקון להיכנס לציטופלסמה, מה שמגדיל את כמות סימון החלבון18. לפיכך, תאים מתים יהיו בהירים יותר מתאים חיים, הכלולים בשער המוגדר. כוונן CD45-APC [ציר x] ו- vGLUT1-PE [ציר y]; האוכלוסייה שנמצאת מעל שער הסף, שבה לא זוהו אירועים חיוביים בדגימת הטחול (בקרה שלילית ביולוגית פנימית, איור 1E) נחשבת לחלק החיובי vGLUT1 בדגימה. 2. איתור בליעה חוץ גופית של סינפטוזומים גולמיים על ידי מיקרוגליה הכנת סינפטוזום גולמי ותיוג pHrodo אדוםהערה: כל השלבים הבאים צריכים להתבצע על קרח.בצע את שלבים 1.1 עד 1.2. העבירו את המוח לצלוחית פטרי מלאה ב-1 מ”ל של מדיום תאי עצב קרים כקרח ונתחו בזהירות את ההיפוקמפוס. תמיד לשמור את צלחת פטרי על קרח. השתמשו בהיפוקמפי לבידוד תאי מיקרוגליה בשלב הבא. העבר את שאר המוח (למעט המוח הקטן ופקעת הריח) להומוגנייזר Dounce מלא ב -1 מ”ל של מגיב מיצוי חלבון סינפטי ונתק בעדינות את הרקמה באמצעות המזיק הרופף עם כ~ 30 שביתות. יש להשלים את מעכב הפרוטאז בטבליה אחת לכל 10 מ”ל של מגיב המיצוי ולבודד סינפטוזומים בהתאם להוראות היצרן.הערה: ריאגנטים למיצוי חלבונים סינפטיים, כגון SynPER19, משמשים להכנת סינפטוזומים המכילים חלבונים פעילים ביולוגית לפני ואחרי סינפטיים. ממיסים את כדורית הסינפטוזום הגולמי ב-500 מיקרוליטר של תמיסת 0.1 M Na2CO3 . מכתימים את דגימת הסינפטוזום עם 10 μL של 0.2 mM pHrodo אדום. יש לדגור על דגימות הסינפטוזום הגולמי בטמפרטורת החדר (24-25 מעלות צלזיוס) למשך שעה וחצי בתסיסה עדינה. הוסף 1 מ”ל של DPBS קר לדגימה, צנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות מלאה (20,815 × גרם), ושאפו את הסופרנאטנט. חזור על שלב 2.1.5 עבור 7x בסך הכל כדי להסיר pHrodo Red מוגזם לא מאוגד מהדגימות. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, בצע בדיקת BCA סטנדרטית כדי לכמת את ריכוזי החלבון של הדגימה. אופציונלי: להקפיא דגימות סינפטוזום ב-DPBS עם 5% DMSO באמצעות חנקן נוזלי ולשמר אותן למשך 3 שבועות בטמפרטורה של -80°C. כסו את הצינורות ברדיד אלומיניום כדי לשמור על חשיפה מינימלית לאור. In vitro בדיקת בליעת סינפטוזום גולמי באמצעות מיקרוגליה בוגרת מבודדת טרייההכינו aCSF ואזן אותו עם 95% O2:5% CO2 למשך 30 דקות.הערה: עבור השלבים 2.2.2-2.2.4, בצע את הוראות היצרן להכנת תמיסת עיכול מבוססת פפאין. הוסף 4 מ”ל של aCSF בקבוקון 2 בערכת פפאין. מניחים את הבקבוקון באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך ~ 10 דקות עד שתמיסת הפפאין נראית ברורה. הוסף 400 μL של aCSF בקבוקון 3 בערכת פפאין. מערבבים בעדינות במשך ~10 פעמים על ידי פיפטינג איטי. הוסף 200 μL מבקבוקון 3 לבקבוקון 2 (משוחזר בשלב 2.2.3). שמור את שאר הבקבוקון 3. קח את ההיפוקמפוס שנותח בשלב 2.1.2 וטחן את ההיפוקמפוס המנותח באמצעות אזמל. העבר את ההיפוקמפי הטחון לצינור דיסוציאטור רקמות מלא 2 מ”ל של תמיסת אנזים שהוכנה בשלב 2.2.5. הכנס את הצינור לדיסוציאטור הרקמה והפעל את התוכנית: 37C_ABDK_01 (לוקח ~ 30 דקות). מניחים את הדגימות באמבט מים ב 37 ° C למשך ~ 20 דקות ו triturate את התערובת כל 5 דקות באמצעות צינור 1 מ”ל מבלי ליצור בועות.הערה: יש להמשיך בתהליך זה עד שהרקמה מנותקת לחלוטין ונראית הומוגנית לחלוטין כדי להבטיח דיסוציאציה יעילה. כל שלבי הצנטריפוגה הבאים מתבצעים ב 4 oC אם לא צוין אחרת. הסר בזהירות את מתלה התאים העכור לצינור וצנטריפוגה חדשים של 15 מ”ל ב 300 × גרם למשך 5 דקות. במהלך תקופה זו של 5 דקות, הכינו את תערובת השטיפה הבאה (5 מ”ל) לדגימה; הוסף 500 μL של פתרון מעכב אלבומין-ovomucoid reconstituted שסופק בערכת papain ל 4.5 מ”ל של aCSF. מוסיפים את התמיסה הנותרת בבקבוקון 3 משלב 2.2.5 לתערובת השטיפה. השליכו את הסופרנאטנט משלב 2.2.8 ומיד השהו מחדש את גלולת התא בתמיסת תערובת השטיפה. העבירו את הדגימה דרך מסנן 70 מיקרומטר לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 5 מ”ל. צנטריפוגה את הדגימות ב 300 × גרם במשך 5 דקות. המשך עם שלב הצנטריפוגה ההדרגתית של Percoll שהוסבר קודם לכן בשלבים 1.7-1.9. השהה מחדש את התאים בזהירות במאגר צביעת MACS על ידי צנרת איטית למעלה ולמטה. לדגור את הדגימות במשך 15 דקות ב 4 ° C. הוסף 1 מ”ל של חיץ MACS לכל דגימה וצנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 8 דקות. להשעות מחדש את התאים ב 500 μL של מאגר MACS. מקם את עמודות הבחירה החיובית במפריד המגנטי. אזן את העמודות על-ידי שטיפתן עם 3 מ”ל של מאגר MACS. מערבבים בעדינות ומורחים 500 μL של תרחיף התא על העמודה. שטוף את העמודות 3x עם 3 מ”ל של מאגר MACS. הסר את העמודים מהמפריד המגנטי והנח אותם על צינורות חרוטיים של 15 מ”ל. הוסף 5 מ”ל של מאגר MACS לעמודה ומיד לשטוף את התאים באמצעות plumper. צנטריפוגה את הדגימות ב 300 × גרם במשך 10 דקות. במהלך תקופה זו, להכין 20 מ”ל של 40% FBS ב DPBS. לחמם מראש 1 מ”ל של DMEM לכל מדגם עד 37 °C באמבט מים. ממיסים את גלולת התא הסופית ב 1 מ”ל של DMEM שחומם מראש. זרעו סביב ~ 150,000-200,000 תאים ב 500 μL של DMEM שחומם מראש לכל באר בצלחת 24 בארות. כבקרה, זרעו מספר דומה של תאים ב 1-2 בארות נוספות. בדוק את מפגש התאים בכל הבארות באמצעות מיקרוסקופ אור.הערה: אם אזור היעד במוח הוא היפוקמפוס או אזורי מוח קטנים יחסית, ניתן לאגד 5 עכברים לכל דגימה (n) כדי לבודד ~150,000 מיקרוגליה. עבור המוח כולו, עכבר אחד לכל n יספיק כדי להשיג מספר דומה של תאים באמצעות שני פרוטוקולי הבידוד. לחלופין, ~ 40,000 תאים יכולים להיות מצופים בלוחות 96 בארות בנפח סופי של 100 μL כדי להתחיל את בדיקת הבליעה. פעולה זו מפחיתה את מספר התאים המנותחים, אך גם מפחיתה את מספר העכברים המשמשים לכל n. מחסור בחלבון עקב חוסר FCS ב- DMEM יגרום לפאגוציטוזה. לדגור על הצלחת במשך 1-2 שעות באינקובטור (37 ° C ו 5% CO2).הערה: שלב זה נועד לתאים להתאושש מההשפעות המועדות ללחץ של הליך הבידוד לפני תחילת בדיקת הבליעה התפקודית. קח 250 μL של בינוני מכל באר לאט מאוד, להוסיף 250 μL של DMEM טרי שחומם מראש לכל באר, ולהוסיף 3 מיקרוגרם של pHRodo סינפטוזומים מסומנים אדום בחלק העליון. בדוק את מפגש התאים בכל הבארות באמצעות מיקרוסקופ אור.עבור בארות הבקרה השליליות, הוסף את אותה כמות של סינפטוזומים ללא תווית לבאר הנוספת שנזרעה עם תאים. עבור בארות בדיקה, ודא כי באר 1 מכיל רק תאים; באר 2 מכילה תאים+ סינפטוזומים ללא תווית; באר-3 מכיל תאים+ 3 מיקרוגרם של pHrodo אדום; באר 4 מכיל DMEM + 3 מיקרוגרם של pHrodo אדום. לדגור את התאים עם סינפטוזומים במשך 2 שעות באינקובטור (37 ° C ו 5% CO2). מוציאים את המדיום ושוטפים את הבארות ב-DPBS קר. הוסף 200 μL של תמיסת טריפסין/EDTA לכל באר כדי לנתק את התאים למשך 35 שניות. הוסף 1 מ”ל של 40% FBS ב- DPBS לכל באר והעבר את התאים לצינור פוליפרופילן 5 מ”ל דרך המסננת. שמור הן את הצלחת ואת הצינור על קרח במהלך תהליך זה כדי להקל על ניתוק של תאים. שטפו כל באר פעמיים באמצעות 500 מיקרוליטר של DPBS קר כקרח. צנטריפוגה הדגימות שנאספו ב 500 × גרם במשך 5 דקות. יש להשהות מחדש את התאים בתמיסת הצביעה המכילה 1/200 CD16/CD32 ב-100 מיקרוליטר של חיץ FACS ולדגור במשך 10 דקות על קרח. לאחר הדגירה, מוסיפים CD11b ו-CD45 לתמיסת הצביעה עם ריכוז סופי של 1/100 מכל אחד. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך. שטפו את הדגימות עם 1 מ”ל של חיץ FACS וצנטריפוגו אותן ב 300 × גרם במשך 10 דקות. השהה מחדש את הגלולה במאגר FACS של 250 מיקרוליטר ותעד לפחות 100,000 אירועים בסך הכל באמצעות ציטומטריית זרימה. נתח את עוצמת הפלואורסצנטיות האדומה pHrodo ממיקרוגליה CD11b ++/CD45+ . אסטרטגיית גאטינג (איור 2C)התאם את השער הראשי: אזור פיזור קדמי (FSC-A) [ציר x] ואזור פיזור צד (SSC-A) [ציר x] כדי לכלול את אוכלוסיית תאי המיקרוגליה באזור המגודר ולא לכלול את הפסולת התאית. התאם את אזור הפיזור קדימה (FSC-A) [ציר x] ואת גובה הפיזור קדימה (FSC-H) [ציר y] כדי לא לכלול כפילויות. סינגלים מופיעים באלכסון בתרשים נקודה זה. התאם CD11b-PECy7 [ציר y] ו- CD45-APC [ציר x] ושער את האוכלוסייה עם CD11b ברמת פני שטח גבוהה ורמה בינונית של CD45 כמיקרוגליה. חשב את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית של pHrodo-PE מאוכלוסייה זו. השתמש באותם תאים מודגרים עם סינפטוזומים ללא תווית כמו הבקרה השלילית.