Quantificazione dell'inghiottimento microgliale di materiale sinaptico mediante citometria a flusso

Una visione generale della procedura sperimentale è illustrata graficamente nella Figura 1A. Tutti gli esperimenti che prevedono la manipolazione di animali vivi sono stati eseguiti in stretta conformità con la legge tedesca sulla protezione degli animali e sono stati approvati dall’Ufficio regionale per la salute e i servizi sociali di Berlino (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlino, Germania). I topi sono stati alloggiati in gruppi in gabbie ventilate in condizioni di laboratorio standard con un ciclo luce/buio di 12:12 ore presso la struttura del centro animale del Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC). Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum. Vedere la Tabella 1 per la composizione di tamponi e reagenti e la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i reagenti, gli strumenti e i materiali utilizzati in questo protocollo. Per il test specifico per vGLUT1, abbiamo utilizzato il termine in vivo* in tutto il manoscritto per riconoscere che la citometria a flusso richiede l’omogeneizzazione dei tessuti e l’isolamento cellulare e che le microglia mostrano circa il 95% di vitalità dopo la procedura di isolamento (Figura 1B e Figura S1 supplementare). Pertanto, mantengono la loro capacità di inghiottire il materiale sinaptico ex vivo, per un breve periodo, fino alla fissazione. Pertanto, la quantificazione della microglia vGLUT1+ comprende sia l’inghiottimento in vivo che quello ex vivo a breve termine fino alla fase di fissazione. 1. Colorazione intracellulare vGLUT1 per la rilevazione dell’inghiottimento in vivo* delle sinapsi glutammatergiche da parte della microglia NOTA: La seguente procedura di isolamento cellulare è adattata da16. Tutte le fasi dell’isolamento cellulare devono essere eseguite su ghiaccio. Anestetizzare i topi utilizzando l’iniezione intraperitoneale di pentobarbital. Perfondere i topi per via intracardica con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) ghiacciata per ~2 minuti.NOTA: Viene utilizzato un mouse per campione (n). Estrarre il cervello dal cranio e conservarlo in 1 ml di terreno di cellule neurali.NOTA: Il mezzo cellulare neurale, come il terreno Hibernate-A, viene utilizzato per garantire un’elevata vitalità delle cellule dopo il processo di dissociazione tissutale. Trasferire il cervello in una capsula di Petri riempita con 1 ml di terreno cellulare neurale ghiacciato e sezionare l’ippocampo come descritto in precedenza17. Trasferire l’ippocampo in un omogeneizzatore Dounce riempito con 1 mL di terreno di cellule neurali e dissociare il tessuto usando il pestello sciolto con circa ~25 colpi delicati. Posizionare un colino da 70 μm su una provetta in polipropilene da 5 mL e aggiungere 500 μL di terreno di cellule neurali. Trasferire l’omogeneizzato di tessuto nella provetta in polipropilene da 5 mL attraverso il colino. Sciacquare l’omogeneizzatore Dounce 2 volte con 1 mL di terreno di coltura neurale fredda e centrifugare i campioni a 400 × g per 8 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μl di DPBS ghiacciato mediante pipettaggio delicato. Garantire una sospensione omogenea e completare il volume finale a 1,5 mL utilizzando DPBS. Aggiungere 500 μL di soluzione isotonica di Percoll al campione, risospenderla delicatamente e sovrapporla con altri 2 ml di DPBS freddo. Centrifugare i campioni a 3.000 × g per 10 minuti con la massima accelerazione e senza freni. Aspirare lo strato superiore e il disco mielinico nella fase intermedia.NOTA: Tutte le seguenti fasi di centrifugazione vengono eseguite a 4 oC se non diversamente specificato. Aggiungere 4 mL di DPBS freddo e centrifugare i campioni a 400 × g per 10 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μl di soluzione di colorazione di vitalità fissabile e incubare i campioni per 30 minuti a 4 °C. Aggiungere 1 mL di DPBS freddo al campione e centrifugare i campioni a 300 × g per 5 minuti. Eliminare il surnatante e aggiungere 100 μL di soluzione colorante CD16/CD32 (1/200 in tampone FACS). Agitare per ~5 s e incubare per 10 minuti a 4 °C.NOTA: La colorazione CD16/CD32 è un pretrattamento per ridurre al minimo il legame non specifico degli anticorpi alle cellule portatrici di FcR, come la microglia, prima di applicazioni come la citometria a flusso. Aggiungere 1 mL di tampone FACS al campione e centrifugare a 300 × g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e aggiungere 100 μL di colorante master mix-I (1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G in 1x tampone FACS). Incubare i campioni per 20 minuti a 4°C al buio. Aggiungere 1 mL di tampone FACS al campione e centrifugare a 300 × g per 5 minuti. Risospendere il pellet in 250 μL di tampone di fissaggio. Incubare a 4 °C per 25 min. Aggiungere 2 mL di tampone 1x permeabilizzazione (PERM) e centrifugare 300 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante e aggiungere 100 μL di vGLUT1 o di soluzione colorante per il controllo dell’isotipo. Agitare per ~5 s e incubare i campioni a 4 °C per 50 min. Aggiungere 2 mL di 1x tampone PERM e centrifugare 300 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante e aggiungere 2 mL di tampone FACS ai campioni. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 250 μL di tampone FACS e far passare i campioni attraverso un filtro filtrante da 40 μm. Analizza l’intensità della fluorescenza vGLUT1 da microglia singola/vitale/CD11b++/CD45+ utilizzando la citometria a flusso. Utilizzare i macrofagi della milza come controllo negativo per ogni esperimento.Isolare gli splenociti comprimendo delicatamente il tessuto della milza tritato attraverso un filtro a filtro da 70 μm due volte. Sciacquare i filtri con 40 mL di DPBS e raccogliere la sospensione in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare 350 × g per 10 minuti e risospendere il pellet risultante in una soluzione da 1 mL di tampone per lisi dei globuli rossi. Incubare per 10 minuti con ghiaccio. Aggiungere 10 mL di DPBS al campione dopo l’incubazione e centrifugare a 350 × g per 10 min. Procedere con i passaggi di colorazione spiegati tra i passaggi 1.11 e 1.17.NOTA: La strategia di gating è fornita nella Figura S2 supplementare per definire i macrofagi della milza come CD11b ++/ CD45 ++/ Popolazione di cellule vitali. Strategia di gating (Figura 1)Cancello primario: Regolare l’area di dispersione anteriore (FSC-A) [asse x] e l’area di dispersione laterale (SSC-A) [asse y] per includere la popolazione di microglia nell’area recintata ed escludere i detriti cellulari. Regolare l’area di dispersione in avanti (FSC-A) [asse x] e l’altezza di dispersione in avanti (FSC-H) [asse y] per escludere i doppietti. I singoletti appaiono come una diagonale su questo grafico a punti. Regolare CD11b-PECy7 [asse y] e CD45-APC [asse x] e portare la popolazione con un alto livello superficiale di CD11b e un livello medio di CD45 come microglia. Escludere le celle morte nel gate negativo FITC[asse y]. FACOLTATIVO: Escludere anche le cellule positive per Ly6C- e Ly6G-FITC nel gate FITC negativo per escludere dall’analisi i macrofagi associati al SNC.NOTA: A differenza delle cellule vive, le cellule morte con membrane compromesse consentono al colorante di vitalità fissabile di entrare nel citoplasma, aumentando la quantità di marcatura delle proteine18. Pertanto, le cellule morte saranno più luminose delle cellule vive, che sono incluse nel cancello definito. Regolare CD45-APC [asse x] e vGLUT1-PE [asse y]; la popolazione che si trova al di sopra del cancello di soglia, in cui non sono stati rilevati eventi positivi nel campione di milza (controllo biologico interno negativo, Figura 1E) è considerata la frazione vGLUT1-positiva nel campione. 2. Rilevamento dell’engulfment in vitro di sinaptosomi grezzi da parte della microglia Preparazione del sinaptosoma grezzo e marcatura con pHrodo RedNOTA: Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti su ghiaccio.Seguire i passaggi da 1.1 a 1.2. Trasferisci il cervello in una capsula di Petri riempita con 1 ml di terreno di cellule neurali ghiacciato e seziona attentamente l’ippocampo. Conservare sempre la capsula di Petri in ghiaccio. Usa l’ippocampo per l’isolamento della microglia nel passaggio successivo. Trasferire il resto del cervello (escluso il cervelletto e il bulbo olfattivo) in un omogeneizzatore Dounce riempito con 1 ml di reagente per l’estrazione di proteine sinaptiche e dissociare delicatamente il tessuto utilizzando il pestello sciolto con circa ~ 30 colpi. Integrare l’inibitore della proteasi in una compressa per 10 ml di reagente di estrazione e isolare i sinaptosomi secondo le istruzioni del produttore.NOTA: I reagenti per l’estrazione di proteine sinaptiche, come SynPER19, vengono utilizzati per preparare sinaptosomi che contengono proteine pre e postsinaptiche biologicamente attive. Sciogliere il pellet di sinaptosoma grezzo in 500 μL di soluzione 0,1 M Na2CO3 . Colorare il campione di sinaptosoma con 10 μL di pHrodo Red da 0,2 mM. Incubare i campioni di sinaptosoma grezzo a temperatura ambiente (24-25 °C) per 1,5 ore agitando delicatamente. Aggiungere 1 mL di DPBS freddo sul campione, centrifugare per 1 minuto alla massima velocità (20,815 × g) e aspirare il surnatante. Ripetere il passaggio 2.1.5 per 7 volte in totale per rimuovere il pHrodo Red in eccesso non legato dai campioni. Dopo l’ultima centrifugazione, eseguire un test standard di BCA per quantificare le concentrazioni proteiche del campione. Opzionale: congelare i campioni di sinaptosoma in DPBS con DMSO al 5% utilizzando azoto liquido e conservarli per 3 settimane a -80 °C. Copri i tubi con un foglio di alluminio per mantenere l’esposizione alla luce minima. In vitro Saggio di inghiottimento dei sinaptosomi grezzi utilizzando microglia adulta appena isolataPreparare l’aCSF ed equilibrarlo con il 95% di O2:5% di CO2 per 30 min.NOTA: Per i passaggi 2.2.2-2.2.4, seguire le istruzioni del produttore per la preparazione della soluzione digestiva a base di papaina. Aggiungere 4 mL di aCSF al flaconcino 2 del kit di papaina. Mettere la fiala in un bagnomaria a 37 °C per ~10 minuti fino a quando la soluzione di papaina appare limpida. Aggiungere 400 μL di aCSF al flaconcino 3 del kit di papaina. Miscelare delicatamente per ~10 volte mediante pipettaggio lento. Aggiungere 200 μl dal flaconcino 3 al flaconcino 2 (ricostruito al punto 2.2.3). Conservare il resto della fiala 3. Prendi l’ippocampo sezionato al punto 2.1.2 e trita l’ippocampo sezionato usando un bisturi. Trasferire l’ippocampo tritato in una provetta dissociatrice tissutale riempita con 2 mL di soluzione enzimatica preparata al punto 2.2.5. Posizionare la provetta nel dissociatore tissutale ed eseguire il programma: 37C_ABDK_01 (richiede ~30 min). Mettere i campioni in un bagno d’acqua a 37 °C per ~20 minuti e triturare la miscela ogni 5 minuti utilizzando una pipetta da 1 ml senza formare bolle.NOTA: Questo processo deve essere continuato fino a quando il tessuto non è completamente dissociato e appare completamente omogeneo per garantire una dissociazione efficiente. Tutte le seguenti fasi di centrifugazione vengono eseguite a 4 oC, se non diversamente specificato. Rimuovere con cautela la sospensione di cellule torbide in una nuova provetta da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 5 minuti. Durante questo periodo di 5 minuti, preparare la seguente miscela di lavaggio (5 ml) per campione; aggiungere 500 μL di soluzione ricostituita di inibitore dell’albumina-ovomucoide fornita nel kit della papaina a 4,5 mL di aCSF. Aggiungere la soluzione rimanente nel flaconcino 3 del passaggio 2.2.5 alla miscela di lavaggio. Eliminare il surnatante del passaggio 2.2.8 e risospendere immediatamente il pellet cellulare nella soluzione di miscelazione di lavaggio. Passare il campione attraverso un filtro da 70 μm a una nuova provetta per microcentrifuga da 5 mL. Centrifugare i campioni a 300 × g per 5 minuti. Procedere con la fase di centrifugazione in gradiente Percoll spiegata in precedenza nei passaggi 1.7-1.9. Risospendere accuratamente le cellule nel tampone di colorazione MACS pipettando lentamente su e giù. Incubare i campioni per 15 minuti a 4 °C. Aggiungere 1 mL di tampone MACS a ciascun campione e centrifugare a 300 × g per 8 minuti. Risospendere le cellule in 500 μL di tampone MACS. Posizionare le colonne di selezione positive nel separatore magnetico. Equilibrare le colonne risciacquandole con 3 mL di tampone MACS. Miscelare delicatamente e applicare 500 μl di sospensione cellulare sulla colonna. Lavare le colonne 3 volte con 3 mL di tampone MACS. Rimuovere le colonne dal separatore magnetico e posizionarle su provette coniche da 15 mL. Aggiungere 5 mL di tampone MACS sulla colonna e sciacquare immediatamente le cellule con un plumper. Centrifugare i campioni a 300 × g per 10 minuti. Durante questo periodo, preparare 20 ml di FBS al 40% in DPBS. Preriscaldare 1 mL di DMEM per campione fino a 37 °C a bagnomaria. Sciogliere il pellet cellulare finale in 1 mL di DMEM preriscaldato. Semina circa ~150.000-200.000 cellule in 500 μL di DMEM preriscaldato per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Come controllo, seminare un numero simile di cellule in 1-2 pozzetti extra. Controllare la confluenza delle cellule in tutti i pozzetti utilizzando un microscopio ottico.NOTA: Se la regione cerebrale bersaglio è l’ippocampo o regioni cerebrali relativamente piccole, è possibile raggruppare 5 topi per campione (n) per isolare ~150.000 microglia. Per l’intero cervello, 1 topo su n sarà sufficiente per ottenere un numero simile di cellule utilizzando entrambi i protocolli di isolamento. In alternativa, ~40.000 cellule possono essere piastrate in piastre da 96 pozzetti in un volume finale di 100 μL per avviare il saggio di inghiottimento. Ciò riduce il numero di cellule analizzate, ma riduce anche il numero di topi utilizzati per n. La deprivazione proteica dovuta alla mancanza di FCS nel DMEM innescherà la fagocitosi. Incubare la piastra per 1-2 ore nell’incubatore (37 °C e 5% CO2).NOTA: Questa fase mira a far sì che le cellule si riprendano dagli effetti inclini allo stress della procedura di isolamento prima dell’inizio del saggio di inghiottimento funzionale. Prelevare 250 μL di terreno da ciascun pozzetto molto lentamente, aggiungere 250 μL di DMEM fresco preriscaldato a ciascun pozzetto e aggiungere 3 μg di sinaptosomi marcati con pHRodo Red sulla parte superiore. Controllare la confluenza cellulare in tutti i pozzetti utilizzando un microscopio ottico.Per i pozzetti di controllo negativo, aggiungere la stessa quantità di sinaptosomi non marcati al pozzetto extra seminato con le cellule. Per i pozzetti di prova, assicurarsi che il pozzetto 1 contenga solo celle; il pozzetto 2 contiene cellule+ sinaptosomi non marcati; pozzetto-3 contiene cellule + 3 μg di pHrodo Red; il pozzetto 4 contiene DMEM + 3 μg di pHrodo Red. Incubare le cellule con i sinaptosomi per 2 ore nell’incubatore (37 °C e 5% di CO2). Estrarre il terreno e lavare i pozzetti con DPBS freddo. Aggiungere 200 μl di soluzione di tripsina/EDTA per pozzetto per staccare le celle per 35 s. Aggiungere 1 mL di FBS al 40% in DPBS per pozzetto e trasferire le cellule in una provetta di polipropilene da 5 mL attraverso il colino. Tenere sia la piastra che la provetta sul ghiaccio durante questo processo per facilitare il distacco delle cellule. Lavare ogni pozzetto 2 volte utilizzando 500 μl di DPBS ghiacciato. Centrifugare i campioni raccolti a 500 × g per 5 min. Risospendere le cellule nella soluzione colorante contenente 1/200 di CD16/CD32 in 100 μL di tampone FACS e incubare per 10 minuti su ghiaccio. Dopo l’incubazione, aggiungere CD11b e CD45 alla soluzione colorante con una concentrazione finale di 1/100 da ciascuno. Incubare i campioni per 20 minuti a 4 °C al buio. Lavare i campioni con 1 mL di tampone FACS e centrifugarli a 300 × g per 10 minuti. Risospendere il pellet in 250 μL di tampone FACS e registrare almeno 100.000 eventi totali utilizzando la citometria a flusso. Analizza l’intensità della fluorescenza di pHrodo Red dalla microglia CD11b++/CD45+ . Strategia di gating (Figura 2C)Regolare il cancello primario: Forward Scatter Area (FSC-A) [asse x] e Side Scatter Area (SSC-A) [asse x] per includere la popolazione di microglia nell’area gated ed escludere i detriti cellulari. Regolare l’area di dispersione in avanti (FSC-A) [asse x] e l’altezza di dispersione in avanti (FSC-H) [asse y] per escludere i doppietti. I singoletti appaiono come una diagonale su questo grafico a punti. Regolare CD11b-PECy7 [asse y] e CD45-APC [asse x] e selezionare la popolazione con CD11b di alto livello superficiale e livello medio di CD45 come microglia. Calcola l’intensità mediana di fluorescenza di pHrodo-PE da questa popolazione. Utilizzare le stesse cellule incubate con sinaptosomi non marcati come controllo negativo.