Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
Ultrasonido se refiere a cualquier onda de presión de sonido oscilante con una frecuencia mayor que el límite superior de la capacidad auditiva humana (~ 20 kHz) 1. Ultrasonido de baja frecuencia en el intervalo de 20-60 kHz se ha utilizado en el laboratorio como un medio de generación de emulsiones, la preparación de muestras celulares para la extracción de ácido nucleico, para la interrupción del tejido, y para una variedad de otras pruebas. La utilidad de ultrasonido de baja frecuencia se ha extendido también a la configuración industrial para la soldadura, la limpieza de diversos materiales, y en el procesamiento de materiales. Comercialmente generadores de ultrasonido disponibles vienen en frecuencias que van desde 18 hasta 60 kHz, y en gran escala de potencias 100-1,200 W.
Aunque la ecografía ha sido utilizado en el ámbito clínico para diagnóstico por imagen, se ha aplicado como una modalidad terapéutica sólo recientemente. Ultrasonido ≥1 MHz es capaz de interrumpir de forma segura los cálculos urinarios (piedras en el riñón) y cálculos biliares (piedras en ªe vesícula biliar o en el hígado) en pacientes para reducir los síntomas 2,3. Este enfoque conocido como litotricia extracorpórea (ESWL) actualmente se aplica ampliamente en la clínica (más de un millón de pacientes son tratados anualmente con ESWL en los Estados Unidos solamente 4), y ofrece una modalidad por la cual no invasiva romper los cálculos con daño colateral mínimo a través del uso de pulsos acústicos aplicado externamente, enfocado, de alta intensidad 2-4.
Debido a las fuerzas de cizallamiento únicas directos, así como burbujas de cavitación generados por ultrasonidos de alta intensidad, estas metodologías han sido examinados en la terapia del cáncer para el tratamiento de carcinoma de próstata resistente a la castración y el adenocarcinoma de páncreas en un enfoque conocido como ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU ) 5-8. De una manera muy similar a la LEOC, HIFU utiliza múltiples haces de ultrasonidos y los concentra en una esfera de actividad seleccionada para generar temperaturas de 60 ° C o higella a través de la utilización de la energía acústica, la inducción de necrosis coagulativa en el tejido diana 5. Aunque en la actualidad existen otras modalidades de ablación térmica (ablación por radiofrecuencia y la ablación por microondas), HIFU ofrece una clara ventaja sobre estos métodos en que es la única modalidad de hipertermia no invasiva 5. HIFU ha logrado resultados mixtos en la clínica y en la actualidad sólo está disponible en los ensayos clínicos 8-11. Sin embargo, el escaso éxito que ha logrado, y el muy prometedor datos in vivo adquiridos a partir de modelos de mamíferos preclínicos han demostrado el potencial de la ecografía en la terapia del cáncer.
En un esfuerzo por mejorar HIFU, los investigadores han intentado combinar ultrasonido con agentes antineoplásicos apropiados para generar una forma de sonochemotherapy. Terapia Sonodynamic (SDT) es una novela modalidad de tratamiento prometedor que ha demostrado impresionante actividad antineoplásica en tanto in vitro como <em> Estudios in vivo 1. Se ha demostrado que el ultrasonido preferentemente daños células malignas basados en el tamaño diferencial entre tales células y los de histología normal 1,5. SDT incorpora agentes especializados conocidos como sonosensitizers para aumentar la extensión del daño preferencial ejercida por ultrasonido contra las células neoplásicas. Mientras que las aplicaciones terapéuticas de SDT se han examinado anteriormente, los sistemas ultrasónicos utilizados normalmente emplean más alta frecuencia de ultrasonido (≥1 MHz), y los efectos de baja frecuencia kHz ultrasonido aún no se ha explorado a fondo. Las frecuencias más bajas de ultrasonido a menudo son más eficientes en la producción de cavitación inercial, un fenómeno que resulta en la destrucción de las células debido al rápido colapso de microburbujas, la inducción de daño físico-12-14. Esta diferencia en la generación de cavitación inercial entre MHz y ultrasonido de baja kHz se ha atribuido al hecho de que las frecuencias de onda inferiores permiten microburbujass más tiempo para crecer por difusión rectificada en el ciclo de expansión media, en consecuencia producir colapsos más violentos durante el ciclo medio tras la compresión 12.
Hemos demostrado previamente que las células de leucemia monocítica humana U937 son sensibles a los ultrasonidos de baja frecuencia (23,5 kHz), y que esta sensibilidad se puede incrementar notablemente mediante la aplicación de agentes antineoplásicos que perturban el citoesqueleto 15. Además, hemos demostrado que las células preferentemente se dañan basan en el tamaño, con células más grandes que exhiben una mayor sensibilidad ultrasónica. Además, las células humanas normales madre hematopoyéticas (hHSCs) y leucocitos en tamaños de celda comparables son mucho más resistentes a sonicación que sus contrapartes neoplásicas 15, lo que sugiere que tentativamente ultrasonido de baja frecuencia se puede utilizar para dañar preferentemente a las células malignas en la presencia de tejido normal.
Para examinar más a fondo la hélice únicapropie- de ultrasonido de baja frecuencia para uso terapéutico potencial, se han desarrollado procedimientos de limpieza y de estabilización para aumentar la eficacia y la fiabilidad de uno de nuestros sistemas de sonicación actuales, el Branson Modelo SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, equipado con un cuerno de 20 mm equipado en una taza de 7,62 cm. Además, hemos sido capaces de determinar las energías precisas muestra de cavitación, así como formas de onda consistentes y amplitud dentro del rango de 40 kHz usando un medidor de cavitación y el osciloscopio con hidrófono. Por refinación y sistematizar nuestros protocolos, hemos sido capaces de establecer la coherencia de nuestros sonicaciones experimentales, lo que nos permite comparar cuantitativamente las sensibilidades sonoras de las células neoplásicas y normales de diferentes linajes histogenéticos. Nuestro protocolo para el sistema de 40 kHz se presenta en extenso detalle para que los laboratorios interesados para ser capaz de realizar experimentos comparables, y evaluar nuestros resultados de los efectos antineoplásicos provocados porultrasonido de baja frecuencia. Además, se examinan los efectos de dosis dependientes de metil-β-ciclodextrina (MeβCD; Figura 1), un agente de colesterol de ozono, en el aumento de la sensibilidad de ultrasonidos de U937 y THP1 células de leucemia monocítica humana.
Para lograr resultados óptimos, especial cuidado se debe tomar para colocar cuidadosamente la muestra y limpiar la unión convertidor bocina. La colocación de la muestra en el cuerno es importante para la obtención de la destrucción celular consistente, como el cambio de la distancia desde el cuerno alterará los focos acústico, y por lo tanto alterar la energía de la muestra se expone a. La energía acústica dentro del cuerno taza se puede mapear usando el metro cavitación para encontrar la posición de máxima cavitación. Además, el medidor de cavitación, junto con el osciloscopio son vitales para la determinación de la intensidad del sonido de las células están siendo expuestos a, así como la homogeneidad de la forma de onda. Por lo tanto, estos instrumentos deben ser utilizados para detectar problemas con el sistema, y ayudar a determinar lo que la solución de problemas puede ser necesaria para corregir la inestabilidad del sistema.
Como se mencionó anteriormente, el sistema de baja frecuencia puede actuar para desgasificar más el agua durante todo el experimento si se ejecuta paravarios minutos antes de muestrear sonicación. Este plazo inicial debe realizarse para obtener un medio de ultrasonidos relativamente desgasificado y resultados así consistentes durante los experimentos. Además, las células no se deben sonicaron en o cerca de la amplitud máxima en la evaluación de la eficacia de sonosensitizers, como la verdadera medida de la sensibilización sería difícil de evaluar. El uso de 33% de la amplitud en el sistema kHz 40 es un lugar ideal, ya que produce daño notable, pero ofrece sonosensitizers amplio espacio para demostrar su eficacia, como se ha demostrado con MeβCD contra U937 y células THP1 (Figura 7). Estos datos también confirman que MeβCD sensibiliza múltiples líneas de leucemia a ultrasonido de baja frecuencia de una manera dependiente de la dosis.
Ha habido una serie de experimentos realizados con mayor frecuencia en el intervalo de 0,75 MHz a 8 MHz mostrando evidencia de burbujas de cavitación intramembrane siendo generado a través de sonicación 17-19. Sin embargo, Questions aún permanecen en lo que respecta a el mecanismo exacto de inducida por ultrasonidos lisis celular 18. Hemos demostrado un vínculo entre el citoesqueleto de fluidización y aumento de la sensibilidad sonic utilizando ultrasonido de baja frecuencia 15, un fenómeno demostrado por otros laboratorios 20, 21. Además, hemos encontrado que los agentes de microfilamentos de alteración tales como citocalasina B potencian la sensibilidad de ultrasonidos en la leucemia múltiple líneas, pero no hHSCs o leucocitos 22, lo que sugiere que la inhibición de la polimerización de actina pueden ser un mecanismo sonosensitizing de particular interés. También hemos observado que la vincristina, un agente de microtúbulos disruptores que inhibe la polimerización de tubulina 23, 24, aumenta notablemente la sensibilidad de ultrasonidos de diferentes tipos de leucemia in vitro incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, y leucemia linfoide aguda. Por el contrario, los agentes del citoesqueleto-dirigida que estabilizan los componentes del citoesqueleto (una paclitaxeld jasplaquinolida) parece hacer que las células resistentes al tratamiento con ultrasonidos, se refleja en menores tasas de lisis celular 22. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que la fluidización de los componentes del citoesqueleto de las células neoplásicas es de hecho un factor importante en el aumento de la eficacia de SDT 25. El presente estudio también demuestra que el agotamiento de colesterol puede ser otro método por el cual para potenciar aún más la sensibilidad de ultrasonidos de células neoplásicas, como las células U937 tratadas con MeβCD están marcadamente sensibilizados a 40 kHz ultrasonido.
Mientras que nuestros protocolos de sonicación han demostrado notable actividad antineoplásica in vitro, la metodología actual se limita a trabajar en modelos de cultivo y pequeños vertebrados que son capaces de encajar en los viales utilizados para ultrasonidos. Hemos demostrado que el pez cebra puede ser sonicado de forma segura utilizando pulsos de ultrasonido de baja frecuencia (20 kHz), y que su tolerancia a los agentes quimioterapéuticos es cuantitativamente comparable adosis toleradas por los modelos murinos, lo que sugiere 26 que el pez cebra portador de un tumor pueden ser utilizados en investigaciones preliminares para evaluar la actividad antineoplásica in vivo de estos protocolos. Sin embargo, la administración de agentes quimioterapéuticos antes de la sonicación de modelos de mamíferos ha sido reportado en el rango de 1 MHz, y tales protocolos probable puede ser ampliado para incorporar ultrasonido de baja frecuencia, así como el colesterol de ozono y agentes del citoesqueleto-dirigida.
Aplicaciones clínicas potenciales de esta forma de SDT pueden implicar sonicación de sangre extracorpóreo en el que agentes antineoplásicos se administran por vía intravenosa (iv) antes de la sangre que son removidos por sonicación 25. Este método elimina posibles barreras de sonido planteados por la anatomía humana, y puede ser una manera eficaz para dañar blastos leucémicos, así como metástasis de tumores sólidos. También es posible que el colesterol de ozono y agentes del citoesqueleto dirigida podríausarse en protocolos HIFU que ya están siendo examinadas en la clínica en un intento de mejorar la eficacia de esta modalidad de tratamiento.
Los métodos descritos en el presente estudio son capaces de evaluar el valor de sonosensitizers potenciales, y el perfeccionamiento del sistema puede mejorar esta utilidad. Sin embargo, hay muchas variables a tener en cuenta cuando se utiliza este tipo de legados ultrasónicas, incluyendo la calidad de suministro de energía, focos acústica, y la variación individual entre los convertidores. Por lo tanto, la investigación futura se centrará en la visualización de las ondas sonoras y la comprensión de su influencia en los resultados. SDT ha demostrado mejorar la lisis celular in vitro y puede llegar a ser clínicamente viable si hay más datos in vivo en modelos de mamíferos se adquieren. Los experimentos que examinan otras características potencialmente explotables de células malignas, así como diversas modalidades combinadas que participan múltiples agentes y ecografía continúan en nuestro laboratorio.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |