Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
אולטראסאונד מתייחס לכל גל לחץ קול נדנוד בתדירות גבוהה יותר מהגבול העליון של יכולות שמיעה אנושיות (~ 20 קילו-הרץ) 1. אולטרסאונד בתדר נמוך בטווח 20-60 קילוהרץ נוצל במעבדה כאמצעי ליצירת תחליבים, הכנת דגימות סלולריות להפקת חומצות גרעין, לשיבוש רקמות, ועבור מגוון רחב של בדיקות אחרות. השירות של אולטרסאונד בתדר הנמוך גם הורחב להגדרה התעשייתית לריתוך, חומרי ניקוי שונים, ובטיפול בחומרים. מסחרי גנרטורים אולטרסאונד זמינים לבוא בתדרים הנעים 18-60 קילוהרץ, ובקנה מידה מלא wattages מ100-1,200 W.
למרות אולטרסאונד משמש כבר זמן רב בהגדרה הקלינית להדמיה לאבחון, זה כבר מיושם ככלים טיפוליים רק לאחרונה. אולטראסאונד ≥1 MHz מסוגל לשבש calculi שתן (אבנים בכליות) וcalculi מרה בשלום (אבנים בהכיס מרה דואר או בכבד) בחולים כדי להפחית סימפטומים 2,3. גישה זו ידועה כריסוק Shockwave extracorporeal (ESWL) עכשיו מיושמת באופן נרחב במרפאת (מטופלים חולים יותר ממיליון בשנה עם ESWL בארצות הברית לבדה 4), ומציעה שיטה שבי להלא פולשני לשבור את calculi עם ניזק סביבתי מינימאלי באמצעות פולסים אקוסטי לשימוש חיצוני בעוצמה גבוהה, ממוקדת, 2-4.
בשל הכוחות הייחודיים הישירים הגז, כמו גם בועות cavitation שנוצרו על ידי אולטרסאונד בעוצמה גבוה, מתודולוגיות אלה נבדקו בטיפול בסרטן לטיפול בסרטן הערמונית עמיד לסירוס ואדנוקרצינומה של לבלב בגישה הידועה כממוקדים בעוצמה גבוהה אולטרסאונד (HIFU ) 5-8. באופן דומה מאוד לESWL, HIFU משתמש קורות אולטרסאונד מרובים ומתמקד באזור מוקדי שנבחר כדי ליצור טמפרטורות של 60 מעלות צלזיוס או HIGשלה באמצעות השימוש באנרגיה האקוסטית, גרימת נמק מִתקַרֵשׁ ברקמות הממוקדות 5. למרות ששיטות אחרות של אבלציה תרמית קיימות כיום (אבלציה בתדר רדיו ואבלציה מיקרוגל), HIFU מציע יתרון ברור על פני שיטות אלה בכך שהוא השיטה hyperthermic לא פולשנית רק 5. HIFU השיג תוצאות מעורבות במרפאת וזמינה כרגע רק בניסויים קליניים 8-11. עם זאת, ההצלחה המוגבלת שהשיג, ומבטיח מאוד בנתונים vivo נרכשו מדגמי יונקים פרה-קליניים הדגימו את הפוטנציאל של אולטרסאונד בטיפול בסרטן.
במאמץ לשפר את HIFU, חוקרים ניסו לשלב אולטרסאונד עם סוכני antineoplastic מתאימים כדי ליצור צורה של sonochemotherapy. טיפול Sonodynamic (SDT) הוא שיטת טיפול חדשנית מבטיחה שהוכיחה פעילות antineoplastic מרשימה בהיא במבחנה <em> מחקרי in vivo 1. הוכח אולטרסאונד שמעדיף נזקי תאים ממאירים המבוססים על ההפרש בין גודל תאים כאלה ואלה של היסטולוגיה הרגילה 1,5. SDT משלב סוכנים מיוחדים הידועים כsonosensitizers להגדיל את היקף הנזק מועדף המופעל על ידי אולטרסאונד נגד תאי neoplastic. בעוד יישומים טיפוליים של SDT כבר נבדקו בעבר, מערכות אולטרא סאונד משמשות בדרך כלל להעסיק אולטרסאונד הגבוה תדר (≥1 MHz), ואת ההשפעות של אולטרסאונד בתדר kHz הנמוך טרם נחקרו באופן מלא. תדרים נמוכים של אולטרסאונד לעתים קרובות יותר בקיאים בהפקת cavitation אינרציה, תופעה שגורמת להרס של תאים עקב מתכווצת המהיר של microbubbles, גרימת נזק physicochemical 12-14. הבדל בדור של cavitation אינרציה בין MHz ואולטרסאונד kHz הנמוך זו יוחס לעובדה שתדרי גל נמוכים יאפשר microbubbleזה יותר זמן לגדול על ידי דיפוזיה לתקן במחצית הרחבת המעגל, וכתוצאה מכך הייצור מתמוטט אלים יותר במחצית המחזור 12 הדחיסה הבאה.
הראינו בעבר כי תאי monocytic אדם U937 לוקמיה רגישים לאולטרסאונד הנמוך תדר (23.5 kHz), ושרגישות זו יכולה להיות מוגברת במידה ניכרת באמצעות היישום של סוכני antineoplastic שלטרוד את שלד התא 15. יתר על כן, יש לנו הראינו שתאים באופן מועדף ניזק שמבוססים על גודל, עם תאים גדולים יותר מציגים רגישות קולית גבוהה יותר. בנוסף, תאים נורמלים אדם hematopoietic גזע (hHSCs) וכדוריות דם לבנות בגדלי תא דומים הרבה יותר עמידים לsonication מאשר עמיתיהם neoplastic 15, בהיסוס טוענים כי אולטרסאונד בתדר הנמוך ניתן להשתמש כדי לפגוע באופן מועדף תאים ממאירים בנוכחות של רקמה נורמלית.
כדי לבחון את האבזר הייחודי נוסףerties של אולטרסאונד בתדר הנמוך לשימוש טיפולי פוטנציאלי, פיתחנו תהליכי ניקוי וייצוב כדי להגדיל את היעילות ואמינה של אחת ממערכות sonication הנוכחיות שלנו, W ברנסון דגם SLPe 150, המשבש סלולארי 40 קילוהרץ, מצויד בצופר 20 מ"מ מצויד לתוך כוס 7.62 סנטימטר. בנוסף, יש לנו כבר הצליח לקבוע אנרגיות מדויקות cavitation המדגם, כמו גם גל עקבי ומשרעת בטווח של 40 קילוהרץ באמצעות מד cavitation ואוסצילוסקופ עם hydrophone. על ידי זיקוק ושיטתי הפרוטוקולים שלנו, יש לנו כבר הצליח להקים עקביות בsonications הניסוי שלנו, ומאפשר לנו להשוות כמותית הרגישויות קולית של תאי אנטינאופלסטיים ונורמלים של שושלות שונות histogenetic. הפרוטוקול שלנו למערכת 40 קילוהרץ מוצג בפירוט רב על מנת למעבדות מעוניינות להיות מסוגל לבצע ניסויים דומים, וכדי להעריך את הממצאים של השפעות antineoplastic שהושרו על ידיאולטרסאונד בתדר נמוך. בנוסף, אנו בוחנים את ההשפעות תלויות מינון של מתיל-β-cyclodextrin (MeβCD; איור 1), סוכן מדלל את כולסטרול, על הגדלת הרגישות קולית של U937 וTHP1 תאים לוקמיה monocytic אנושיים.
כדי להשיג תוצאות אופטימליות, יש לנקוט זהירות מיוחדת למצב בזהירות את המדגם ולנקות את איחוד ממיר-קרן. המיקום של המדגם בקרן הוא חשוב להשגת הרס תא עקבי, כמו שינוי המרחק מהקרן ישנה את המוקדים אקוסטי, ולכן משנה את אנרגיית המדגם חשופה ל. האנרגיה אקוסטית בתוך קרן הכוס יכולה להיות ממופה באמצעות מד cavitation כדי למצוא את המיקום של cavitation המרבי. בנוסף, מטר cavitation, יחד עם אוסצילוסקופ הוא חיוניים לקביעת עוצמת צליל התאים נחשפים ל, כמו גם את ההומוגניות של צורת הגל. לכן, יש להשתמש במכשירים אלה כדי לזהות בעיות במערכת, ולעזור לקבוע מה עשוי להיות נחוצים לפתרון בעיות כדי לתקן חוסר יציבות של מערכת.
כאמור, מערכת התדירות הנמוכה עשויה לפעול לדגה נוספת המים לאורך כל הניסוי אם לא לרוץ לכמה דקות לפני לטעום sonication. זה ראשוני ריצה יש לבצע להניב בינוני יחסית degassed sonication ותוצאות וכך עולות בקנה אחד במהלך ניסויים. בנוסף, לא צריכים להיות sonicated תאים ליד או משרעת המרבי כאשר להערכת היעילות של sonosensitizers, כמידה נכונה של רגישות תהיה קשה להעריך. שימוש במשרעת של 33% על מערכת קילוהרץ 40 היא הגדרה אידיאלית, כפי שהיא מייצרת נזק בולט, אבל מספק מספיק מקום sonosensitizers להפגין יעילותם, כפי שהודגם בMeβCD נגד U937 ותאי THP1 (איור 7). נתונים אלה גם לאשר שMeβCD sensitizes קווי לוקמיה מרובים לאולטרסאונד בתדר הנמוך באופן תלוי מינון.
יש כבר מספר הניסויים שנעשו בתדירות גבוהה יותר בטווח של 0.75 MHz עד 8 מגה-הרץ מציג ראיות של בועות cavitation intramembrane שנוצר באמצעות sonication 17-19. עם זאת, questioNS עדיין יישאר בכל הקשור למנגנון של תמוגה תא מושרה אולטרסאונד 18 המדויק. הראינו קשר בין fluidizing שלד התא והגדיל את רגישות קולית באמצעות אולטרסאונד הנמוך תדר 15, תופעה שהפגינה מעבדות אחרות 20, 21. בנוסף, מצאנו כי סוכני שיבוש-microfilament כגון cytochalasin B להגביר רגישות קולית בלוקמיה מרובה קווים, אך לא hHSCs או כדוריות דם לבנות 22, המצביע על עיכוב של פילמור אקטין עשויה להיות מנגנון sonosensitizing עניין מיוחד. ראינו גם שvincristine, סוכן שיבוש-microtubule שמעכב פילמור טובולין 23, 24, במידה ניכרת מגבירה את הרגישות קולית סוגים שונים של סרטן דם במבחנה כוללים לוקמיה חריפה מיאלואידית, לוקמיה מיאלואידית הכרונית, ולוקמיה החריפה הלימפה. לעומת זאת, סוכנים מכוונים cytoskeletal שלייצב רכיבי cytoskeletal (paclitaxeljasplakinolide ד) מופיע כדי להפוך לתאים עמידים לsonication, באו לידי ביטוי בשיעורים נמוכים יותר של תא תמוגה 22. יחדיו, נתונים אלה תומכים בהשערה כי fluidizing רכיבי cytoskeletal של תאי neoplastic היא אכן גורם חשוב בהגדלת היעילות של SDT 25. המחקר הנוכחי מוכיח כי גם דלדול כולסטרול עשוי להיות שיטה אחרת שבו להגברה נוספת הרגישות קולית של תאי neoplastic, כמו תאי U937 טופל MeβCD במידה ניכרת רגישים עד 40 קילוהרץ אולטרסאונד.
בעוד פרוטוקולי sonication שלנו הוכיחו פעילות antineoplastic מסומנת במבחנה, המתודולוגיה הנוכחית מוגבלת לעבודה במודלי תרבות וחוליות קטנות שיכולים להתאים בבקבוקונים המשמשים לsonication. הראינו דג הזברה שניתן sonicated בבטחה באמצעות אולטרסאונד פעמו תדירות נמוכה (20 קילו-הרץ), ושהסובלנות שלהם לתרופות כימותרפיות היא כמותית דומה למינונים נסבלים על ידי מודלים עכברי 26, המצביעים על כך דג הזברה גידול נושאות ניתן להשתמש בחקירות מקדימות כדי להעריך את פעילות antineoplastic vivo של פרוטוקולים אלה. עם זאת, מתן תרופות כימותרפיות לפני sonication של דגמי יונקים דווח בטווח MHz 1, ויכולים להניח יוארכו פרוטוקולים כגון לשלב אולטרסאונד נמוך תדר, כמו גם כולסטרול-מרוקן וסוכנים מכוונים cytoskeletal.
יישומים קליניים אפשריים של צורה זו של SDT עשויים להיות כרוכים sonication דם extracorporeal בי סוכני antineoplastic מנוהלים דרך הווריד (IV) לפני הוצאתו לדם sonication 25. שיטה זו מסירה מחסומי קול פוטנציאליים שמציבים האנטומיה אנושית, ועשויה להיות דרך יעילה לניזק תקיעות leukemic, כמו גם גרורות מגידולים מוצקים. ייתכן גם שיכלו כולסטרול-מרוקן וסוכנים מכוונים cytoskeletalניתן להשתמש בפרוטוקולי HIFU שכבר נבחנו במרפאת בניסיון לשפר את היעילות של שיטת טיפול זו.
השיטות שתוארו במחקר הנוכחי הן מסוגלים להעריך את הערך של sonosensitizers הפוטנציאלי, ועידון מערכת נוסף עשויים לשפר את השירות הזה. עם זאת, יש הרבה משתנה שיש להתחשב בעת שימוש ממציא קולי כגון, כולל איכות אספקת חשמל, מוקדי אקוסטי, ווריאציה בודדת בין ממירים. לכן, מחקר עתידי יתמקד בלדמיין את הגלים על-קוליים והבנה השפעתם על תוצאות. SDT הוכיח כדי לשפר את תמוגה תא במבחנה ועשוי להיות בר-קיימא מבחינה קלינית, אם יותר בנתונים vivo במודלים של יונקים נרכשים. ניסויים בוחנים מאפיינים אחרים ניתן לנצלם של תאים ממאירים, וכן דרכים משולבות שונים מעורבים סוכנים ואולטרסאונד מרובים להמשיך במעבדה שלנו.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |