Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
超声是指具有一个频率大于人的听觉能力的上限(约20千赫兹)1任何振荡声压力波。低频超声在20-60千赫范围已被用于在实验室中作为产生的乳剂,制备蜂窝样品核酸提取,用于组织破坏的手段,以及用于各种其它的测试。低频超声的效用也已经延伸到工业环境中进行焊接,清洗各种材料,并在材料的加工。市售超声波发生器进来频率范围为18-60 kHz和全面的从瓦W. 100-1,200
虽然超声早已在临床上用于诊断成像时,它已被最近才应用于作为治疗方法。超声≥1兆赫能够安全地破坏泌尿系结石(肾结石)和胆道结石(结石日E在患者胆囊或肝脏),以减轻症状2,3。这种方法被称为体外冲击波碎石术(ESWL)现已广泛应用于临床(超过一百万的患者每年治疗ESWL在美国就有4),并提供了一个模式由以非侵入分手结石最小的附带损伤通过使用外部施加的,有重点,高强度的声波脉冲2-4。
由于独特的直接的剪切力,以及由高强度超声波产生空化气泡,这些方法已经被检查在癌症治疗的去势抗性前列腺癌和胰腺癌中被称为高强度的方法治疗聚焦超声(HIFU )5-8。的方式非常相似的体外冲击波碎石,HIFU使用多个超声波束并把它们聚焦在选定的重点领域,以产生温度为60℃或HIG她通过使用声能的,诱导凝固性坏死,在靶组织5。尽管热消融的其他方式当前存在(射频消融和微波消融术),HIFU提供了一个独特的优势,因为它是唯一的非侵入性的方式温热5这些方法。 HIFU已取得不同的结果在门诊,目前仅在临床试验中可用8-11。然而,有限的成功它已经实现,并且非常有前途的 ,从临床前哺乳动物模型获取的体内数据证明超声波在癌症治疗的潜力。
在努力提高HIFU,研究人员试图超声具有适当的抗肿瘤剂结合生成sonochemotherapy的一种形式。声动力治疗(SDT)是一种有前途的新的治疗方式已经证明令人印象深刻的抗肿瘤活性在体外和<em>体内研究1。它已经显示,超声优先损害基于这样的细胞和那些正常的组织学1,5之间的尺寸差是恶性细胞。 SDT包含称为sonosensitizers增加通过超声对肿瘤细胞施加优先损害的程度专门代理。而SDT的治疗应用已经预先检查,用超声系统通常使用较高频率的超声波(≥1兆赫),以及低千赫频率的超声波的作用还没有得到充分的探讨。超声的较低频率往往在产生惯性空化,这种现象将导致细胞的破坏更精通由于微泡的快速塌陷,诱导理化损伤12-14。在MHz和低千赫超声之间惯性空化的产生这种差别已被归因于一个事实,即低波频率使微泡š更多时间纠正扩散膨胀半周期在以下压缩半周期12成长,从而产生更猛烈的塌陷。
我们以前曾表明,U937人单核细胞白血病细胞对低频超声(23.5千赫)敏感,且这种敏感性可通过抗肿瘤剂的扰乱细胞骨架15的应用来显着增加。此外,我们已经证明,细胞被优先地基于大小破损,具有表现出较高的超声波灵敏度较大的单元。此外,在可比较的小区大小正常人类造血干细胞(hHSCs)和白细胞得多超声处理比其肿瘤对口15更耐,姑且表明低频超声可以用于优先地破坏恶性细胞的正常组织的存在。
为了进一步检验独特的道具低频超声用于潜在治疗用途ERTIES,我们已经开发清洁和稳定程序增加我们当前超声处理系统中的一个的功效和可靠性,布兰森模型SLPE 150瓦,40千赫细胞破碎,配备有20mm的喇叭装到7.62cm的杯子。此外,我们已经能够利用空化仪和示波器与水听器的40千赫的范围内确定准确的样品空化能量,以及一致的波形和幅度。通过提炼和系统化我们的协议,我们已经能够建立一致性在我们的实验超声处理,使我们能够定量比较不同的组织发生谱系的肿瘤细胞和正常细胞的敏感性声音。我们对40千赫的系统协议,提出了广泛的细节,以便感兴趣的实验室能够执行对比实验,并评估我们的通过引起的抗肿瘤效果的研究结果低频超声。此外,我们研究甲基β环糊精的剂量依赖效应(MeβCD; 图1),胆固醇耗竭剂,在增加的U937的超声波灵敏度和THP1人单核细胞白血病细胞。
为了达到最佳的效果,特别应小心仔细地定位样品并清洁变换器喇叭联合。在喇叭样品的放置是用于获得一致的细胞破坏,如从喇叭改变距离将改变的声焦点,并因此改变能量的样品暴露于重要。杯子喇叭内的声能可以使用气穴计找到最大的气穴的位置进行映射。此外,空化仪,连同示波器是用于确定声音强度的细胞被暴露于,以及波形的同质性是至关重要的。因此,这些仪器应该用于检测问题的系统,并且有助于确定哪些故障可能需要校正系统不稳定。
如前面提到的,低频系统可以在整个如果不是运行实验起到进一步脱气的水几分钟前样品超声处理。这个初始运行必须执行以产生在实验过程中相对脱气超声处理介质,从而一致的结果。此外,细胞不应该在或接近最大振幅评估sonosensitizers的功效时,作为增感的真实程度将是难以评估超声处理。在40 kHz的系统上使用33%的幅度是一个理想的环境,因为它产生显着的伤害,但提供sonosensitizers足够的空间来展示其功效,其表现与MeβCD对U937和THP1细胞( 图7)。这些数据也证实,MeβCD敏感性多个白血病线以低频超声以剂量依赖的方式。
已经出现了大量的实验以较高频率为0.75兆赫的范围内进行到8 MHz表示膜内的空化气泡的证据通过超声处理17-19的产生。然而,questioNS仍然在问候超声诱导的细胞裂解18的确切机制。我们已经利用低频超声波15,这种现象由其他实验室20,证明所示的链路的流化细胞骨架之间和增加的声波灵敏度21。此外,我们已经发现,微丝-破坏剂如细胞松弛素B增强在多个白血病超声波灵敏度行,但不hHSCs或白细胞22,提示抑制肌动蛋白聚合的可能特别感兴趣的一个sonosensitizing机制。我们还观察到,长春新碱,微管破坏剂,抑制微管蛋白聚合23,24,显着地增加不同白血病类型的体外超声波灵敏度包括急性骨髓性白血病,慢性骨髓性白血病和急性淋巴性白血病。相比之下,稳定细胞骨架成分骨架定向剂(紫杉醇的ðjasplakinolide)出现,使细胞抵抗超声,通过细胞裂解22的低利率反映。总之,这些数据支持流化的肿瘤细胞的细胞骨架组分的假设确实是在增加的SDT 25的功效的重要因素。本研究还表明,胆固醇耗竭可能是另一种方法,通过它,以进一步增强肿瘤细胞的超声波的灵敏度,如MeβCD处理U937细胞被显着地增感至40千赫的超声波。
而我们的超声处理的协议已经证明,在体外显着的抗肿瘤活性,目前的方法被限制在培养和小脊椎动物模型,其能够适合于用于超声处理的小瓶一起工作。我们已经表明,斑马鱼可以使用脉冲低频超声(20千赫)被安全地进行超声处理,并且它们的耐受化疗剂是定量媲美剂量由鼠模型26的耐受性,这表明荷瘤斑马鱼,可以使用在初步调查,以评估这些协议的体内抗肿瘤活性。然而,施用化疗剂之前,哺乳动物模型的超声处理已经报道在MHz范围为1,并且这样的协议可以容易地扩展到包括低频超声波,以及胆固醇消耗的和细胞骨架的定向剂。
这种形式的SDT的潜在的临床应用可以涉及体外血液超声处理,其中抗肿瘤剂是静脉内给药(ⅳ)之前,血液被移除用于超声处理25。此方法除去由人体解剖学构成潜在声屏障,并可能破坏白血病原始细胞,以及转移从实体瘤的有效方法。它也有可能是胆固醇消耗的和细胞骨架的定向剂可能在那些已经被检查,在诊所中,企图改善这个治疗方法的功效的HIFU协议被使用。
在本研究中所描述的方法能够评估潜在sonosensitizers的值,并且还系统细化可以提高此用途。然而,也有很多使用这种超声波不可同日而语,包括电源质量,声灶和转换器之间的个体差异时要考虑的变量。因此,未来的研究将集中在可视化的声波,并了解他们对结果的影响。 SDT已显示增强细胞裂解的体外和可能被证明是如果有更多的在哺乳动物模型中的体内数据采集临床可行。实验研究的恶性细胞的涉及多个代理和超声其他潜在的可利用的特性,以及各种组合方式在我们的实验室继续。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |