Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
Ultrason se réfère à toute onde de pression sonore oscillant avec une fréquence supérieure à la limite supérieure des capacités auditives de l'homme (~ 20 kHz) 1. Ultrasons à basse fréquence dans la plage de 20 à 60 kHz a été utilisée en laboratoire en tant que moyen de génération d'émulsions, pour la préparation d'échantillons cellulaires extraction d'acide nucléique, pour la rupture des tissus, et pour une variété d'autres essais. L'utilité des ultrasons à basse fréquence a également été étendue à l'environnement industriel pour la soudure, nettoyage divers matériaux, et dans le traitement des matériaux. Disponibles dans le commerce générateurs d'ultrasons viennent dans des fréquences allant de 18 à 60 kHz, et à grande échelle des puissances de 100-1,200 W.
Bien que les ultrasons est utilisé depuis longtemps dans le cadre clinique pour l'imagerie diagnostique, elle a été appliquée comme une modalité thérapeutique que récemment. Ultrason ≥1 MHz est capable de perturber toute sécurité calculs urinaires (calculs rénaux) et calculs biliaires (pierres dans ee vésicule biliaire ou du foie) chez les patients à réduire les symptômes 2,3. Cette approche appelée lithotripsie extracorporelle par ondes (LEC) est maintenant largement appliquée dans la clinique (plus d'un million de patients sont traités chaque année avec la LEC aux États-Unis à eux seuls 4), et offre une modalité par laquelle la non-invasive briser calculs avec minimum de dommages collatéraux grâce à l'utilisation de appliqué à l'extérieur, concentré, haute intensité des impulsions acoustiques 2-4.
En raison des forces uniques directs de cisaillement, ainsi que des bulles de cavitation générées par ultrasons de haute intensité, ces méthodes ont été examinés dans le traitement du cancer pour le traitement du carcinome de la prostate résistant à la castration et l'adénocarcinome du pancréas dans une approche connue sous le nom de haute intensité ultrasons focalisés (HIFU ) 8/5. D'une manière très similaire à la LEC, HIFU utilise plusieurs faisceaux d'ultrasons et les concentre sur une zone focale sélectionnée pour générer des températures de 60 ° C ou higelle par l'utilisation de l'énergie acoustique, ce qui induit une nécrose de coagulation dans le tissu ciblé 5. Bien que d'autres modalités d'ablation thermique existent actuellement (ablation par radiofréquence et micro-ondes ablation), HIFU offre un net avantage sur ces méthodes en ce qu'elle est la seule modalité hyperthermique non-invasive 5. HIFU a atteint des résultats mitigés dans la clinique et est actuellement disponible uniquement dans les essais cliniques 8-11. Cependant, le succès limité qu'il a atteint, et la très prometteuse dans les données acquises in vivo à partir de modèles de mammifères précliniques ont démontré le potentiel des ultrasons dans le traitement du cancer.
Dans un effort pour améliorer HIFU, les chercheurs ont tenté de combiner l'échographie avec des agents antinéoplasiques appropriées pour générer une forme de sonochemotherapy. Thérapie sonodynamique (SDT) est un roman modalité de traitement prometteuse qui a démontré une activité antinéoplasique impressionnante à la fois in vitro et <em> Études in vivo 1. Il a été montré que les ultrasons préférentiellement dommages des cellules malignes basé sur la différence de taille entre ces cellules et celles de 1,5 histologie normale. SDT incorpore des agents spécialisés appelés sonosensibilisateurs pour accroître l'étendue des dommages préférentiel exercée par ultrasons contre les cellules néoplasiques. Alors que les applications thérapeutiques de SDT ont été examinées précédemment, des systèmes à ultrasons utilisés emploient généralement plus élevés ultrasons de fréquence (≥1 MHz), et les effets de la faible fréquence kHz échographie n'a pas encore été pleinement explorées. Les basses fréquences de l'échographie sont souvent plus aptes à la production de cavitation inertielle, un phénomène qui se traduit par la destruction des cellules due à l'effondrement rapide des microbulles, provoquant des dommages physico 12-14. Cette différence dans la génération de la cavitation inertielle entre MHz et bas ultrasons kHz a été attribuée au fait que les fréquences d'ondes inférieures permettent de microbulless plus de temps à se développer par diffusion rectifiée dans le cycle d'expansion de la moitié, en produisant par conséquent effondrements les plus violents au cours de la demi-cycle de compression qui suit 12.
Nous avons précédemment montré que les cellules leucémiques monocytaires humaines U937 sont sensibles aux ultrasons à basse fréquence (23,5 kHz), et en ce que cette sensibilité peut être nettement augmenté grâce à l'application d'agents antinéoplasiques qui perturbent le cytosquelette 15. En outre, nous avons démontré que les cellules endommagées sont préférentiellement basés sur la taille, avec des cellules plus grandes présentant une sensibilité supérieure à ultrasons. En outre, les cellules humaines normales souches hématopoïétiques (de hHSCs) et les leucocytes dans des tailles de cellules comparables sont beaucoup plus résistants à une sonication que leurs homologues néoplasiques 15, ce qui indique à titre provisoire que ultrasons à basse fréquence peut être utilisé pour endommager de manière préférentielle les cellules malignes en présence de tissu normal.
Pour examiner davantage le pilier unique,proprié- de ultrasons à basse fréquence pour une utilisation thérapeutique potentielle, nous avons développé des procédures de nettoyage et de stabilisation pour augmenter l'efficacité et la fiabilité de l'un de nos systèmes de sonication actuelles, le Branson Modèle SLPE 150 W, 40 kHz cellulaire Disrupter, équipé d'un avertisseur sonore de 20 mm équipé en 7,62 cm tasse. En outre, nous avons été en mesure de déterminer précises énergies échantillon de cavitation, ainsi que des formes d'ondes cohérentes et d'amplitude dans la plage de 40 kHz à l'aide d'un mètre de cavitation et l'oscilloscope avec hydrophone. Par raffinage et systématiser nos protocoles, nous avons été en mesure d'établir une cohérence dans nos sonications expérimentales, ce qui nous permet de comparer quantitativement les sensibilités sonores de cellules néoplasiques et normales de différentes lignées histogénétiques. Notre protocole pour le système de 40 kHz est présenté de façon très détaillée pour que les laboratoires intéressés à être capable de réaliser des expériences comparables, et d'évaluer nos conclusions des effets antinéoplasiques provoquées parultrasons à basse fréquence. En outre, nous examinons les effets de doses dépendantes de méthyl-β-cyclodextrine (MeβCD; Figure 1), un agent de cholestérol appauvrissant, sur l'augmentation de la sensibilité des ultrasons U937 et THP1 cellules leucémiques monocytaires humaines.
Pour atteindre des résultats optimaux, une attention particulière doit être prise pour positionner soigneusement l'échantillon et nettoyer l'union convertisseur corne. Le placement de l'échantillon dans la corne est important pour l'obtention de la destruction des cellules cohérente, que de changer la distance de la corne va modifier les foyers acoustique, et donc modifier l'énergie de l'échantillon est exposé. L'énergie acoustique dans la corne de coupe peut être mappé en utilisant le compteur de cavitation pour trouver la position de la cavitation maximale. En outre, l'appareil de mesure de la cavitation, en même temps que l'oscilloscope sont essentiels pour déterminer l'intensité du son, les cellules sont exposés à, ainsi que l'homogénéité de la forme d'onde. Par conséquent, ces instruments doivent être utilisés pour détecter des problèmes avec le système, et aider à déterminer ce qui peut être nécessaire dépannage pour corriger une instabilité du système.
Comme mentionné précédemment, le système à basse fréquence peut agir en outre pour dégazer l'eau tout au long de l'expérience si pas fonctionner pourplusieurs minutes avant de déguster ultrasons. Cette course initiale doit être effectuée pour obtenir un milieu de sonication relativement dégazé et résultats ainsi cohérents au cours des expériences. En outre, les cellules ne doivent pas être exposés à des ultrasons à ou près de l'amplitude maximale lors de l'évaluation de l'efficacité de sonosensibilisateurs, comme la véritable mesure de la sensibilisation serait difficile à évaluer. En utilisant 33% d'amplitude sur le système de kHz 40 est un cadre idéal, car elle produit des dommages importants, mais fournit sonosensibilisateurs amplement d'espace pour démontrer leur efficacité, comme l'a démontré avec MeβCD contre U937 et les cellules THP1 (figure 7). Ces données confirment également que MeβCD sensibilise plusieurs lignes de leucémie à ultrasons à basse fréquence d'une manière dépendant de la dose.
Il ya eu un certain nombre d'expériences effectuées avec une fréquence plus élevée de l'ordre de 0,75 MHz à 8 MHz présentant des signes de bulles de cavitation intramembranaires étant généré par ultrasons 17-19. Cependant, questioNS resterait en ce qui concerne le mécanisme exact de la lyse cellulaire induite par échographie-18. Nous avons montré un lien entre la fluidisation du cytosquelette et une sensibilité accrue sonore utilisant ultrasons à basse fréquence 15, un phénomène démontré par d'autres laboratoires 20, 21. En outre, nous avons constaté que les agents de microfilaments perturbateurs tels que la cytochalasine B potentialisent la sensibilité à ultrasons dans la leucémie multiples des lignes, mais pas hHSCs ou les leucocytes, ce qui suggère que 22 l'inhibition de la polymérisation de l'actine peut être un mécanisme de sonosensitizing un intérêt particulier. Nous avons également observé que la vincristine, un agent de microtubules perturbateurs qui inhibe la polymérisation de la tubuline 23, 24, augmente nettement la sensibilité à ultrasons de différents types de leucémie in vitro, y compris la leucémie myéloïde aiguë, la leucémie myéloïde chronique, et la leucémie lymphoïde aiguë. En revanche, les agents du cytosquelette dirigée qui stabilisent les composants du cytosquelette (paclitaxel und jasplakinolide) semble rendre les cellules résistantes à ultrasons, reflétée par la baisse des taux de lyse cellulaire 22. Pris ensemble, ces données soutiennent l'hypothèse que les composants du cytosquelette fluidification des cellules néoplasiques est en effet un facteur important dans l'augmentation de l'efficacité de la SDT 25. La présente étude démontre également que le cholestérol épuisement peut être un autre procédé permettant de potentialiser encore la sensibilité des cellules néoplasiques à ultrasons, que les cellules U937 MeβCD-traitées sont nettement sensibilisés à ultrasons 40 kHz.
Alors que nos protocoles de sonication ont démontré une activité antinéoplasique marquée in vitro, la méthode actuelle est limitée à travailler dans la culture et petite vertébrés modèles qui sont en mesure d'adapter dans les flacons utilisés pour ultrasons. Nous avons montré que le poisson zèbre peut être soumis à une sonication par impulsions en toute sécurité à l'aide des ultrasons à basse fréquence (20 kHz), et en ce que sa tolérance aux agents chimiothérapeutiques est quantitativement comparable àdoses tolérées par les modèles murins, ce qui suggère que 26 porteur d'une tumeur du poisson zèbre peuvent être utilisés dans investigations préliminaires pour évaluer l'activité antinéoplasique in vivo de ces protocoles. Néanmoins, l'administration d'agents chimiothérapeutiques avant sonication de modèles de mammifères a été rapporté dans la gamme MHz 1, et ces protocoles peut probablement être étendue à incorporer ultrasons à basse fréquence, ainsi que le cholestérol de l'ozone et des agents du cytosquelette dirigée.
Applications cliniques potentielles de cette forme de traitement spécial et différencié peuvent impliquer extracorporelle sonication de sang dans lequel des agents antinéoplasiques sont administrés par voie intraveineuse (iv) avant le sang étant enlevés pour traitement par ultrasons 25. Cette méthode supprime les barrières sonores potentiels posés par l'anatomie humaine, et peut être un moyen efficace pour endommager explosions leucémiques, ainsi que les métastases de tumeurs solides. Il est également possible que le cholestérol de l'ozone et des agents du cytosquelette dirigée pourraitêtre utilisés dans des protocoles de HIFU qui sont déjà en cours d'examen dans la clinique dans une tentative d'améliorer l'efficacité de cette modalité de traitement.
Les méthodes décrites dans la présente étude sont capables d'évaluer la valeur de sonosensibilisateurs potentiels, et l'affinement du système peut améliorer cet utilitaire. Cependant, il ya beaucoup de variables à prendre en considération lors de l'utilisation de tels legs ultrasons, y compris la qualité de l'alimentation, des foyers acoustique, et la variation individuelle entre les convertisseurs. Par conséquent, la recherche future se concentrera sur la visualisation des ondes sonores et de comprendre leur influence sur les résultats. SDT a montré pour améliorer la lyse cellulaire in vitro et peut se révéler cliniquement viable si plus des données in vivo dans des modèles de mammifères sont acquis. Des expériences portant sur d'autres caractéristiques potentiellement exploitables de cellules malignes, ainsi que diverses modalités combinés impliquant plusieurs agents et les ultrasons continuent dans notre laboratoire.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |