Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
Ultraschall bezieht sich auf jedes oszillierende Schalldruckwelle mit einer Frequenz von mehr als der oberen Grenze des menschlichen Gehörs Kapazitäten (~ 20 kHz) 1. Niederfrequenz-Ultraschall im 20-60 kHz-Bereich wurde im Labor als Mittel zur Erzeugung von Emulsionen, die Vorbereitung Zellproben für die Nukleinsäureextraktion, zur Gewebezerstörung genutzt worden sind, und für eine Vielzahl von anderen Tests. Die Nützlichkeit von niederfrequentem Ultraschall wurde auch zur industriellen Umgebung zum Schweißen erweitert, Reinigen verschiedener Materialien und der Materialverarbeitung. Im Handel erhältliche Ultraschallgeneratoren kommen Frequenzen im Bereich von 18 bis 60 kHz, und Full-Scale-Wattagen von 100-1,200 W.
Obwohl Ultraschall ist seit langem in der klinischen Einstellung für die diagnostische Bildgebung verwendet wurden, wurde es als ein therapeutisches Mittel erst kürzlich angewendet. Ultraschall ≥1 MHz ist in der Lage sicher zu stören Harnsteinen (Nierensteine) und Gallensteine (Steine in the Gallenblase oder in der Leber) in Patienten, um die Symptome zu 2,3 zu reduzieren. Dieser Ansatz als extrakorporale Stoßwellenlithotripsie (ESWL) bekannt, ist nun weit verbreitet in der Klinik (mehr als eine Million Patienten werden jährlich mit ESWL in den Vereinigten Staaten allein 4 behandelt) aufgebracht wird, und bietet eine Modalität, durch die nicht-invasiv brechen Kalküle mit minimalen Kollateralschaden durch die Verwendung von extern angelegten, fokussiert, Hochintensitätsschallimpulse 2-4.
Aufgrund der einzigartigen direkten Scherkräfte sowie Kavitationsblasen durch hochintensiven Ultraschall erzeugt wird, haben diese Methoden in der Krebstherapie für die Behandlung von kastrationsresistentem Prostatakarzinom und Adenokarzinom des Pankreas in einem Ansatz als hoher Intensität bekannt sucht fokussierter Ultraschall (HIFU ) 5-8. In einer sehr ähnlichen Weise ESWL verwendet HIFU mehreren Ultraschallstrahlen und fokussiert sie auf eine ausgewählte Fokusbereich auf Temperaturen von 60 ° C oder hig erzeugensie durch die Verwendung von Schallenergie und induziert Koagulationsnekrose in dem Zielgewebe 5. Obwohl auch andere Modalitäten der thermischen Ablation gibt es derzeit (Radiofrequenz-Ablation und Mikrowelle Ablation) bietet HIFU einen deutlichen Vorteil gegenüber diesen Verfahren, dass es das einzige nicht-invasive Hyperthermie Modalität 5. HIFU hat gemischte Ergebnisse in die Klinik erreicht und ist derzeit nur in klinischen Studien 8-11 zur Verfügung. Nichtsdestotrotz haben die begrenzten Erfolg erreicht hat, und die sehr vielversprechend de präklinischen Säugetiermodelle erworben vivo-Daten das Potenzial von Ultraschall in der Krebstherapie gezeigt.
In dem Bemühen, HIFU verbessern, haben Forscher versucht, Ultraschall mit geeigneten antineoplastische Mittel zu kombinieren, um eine Form der sonochemotherapy generieren. Sonodynamischen Therapie (SDT) ist eine vielversprechende neue Behandlungsmethode, die beeindruckende antineoplastische Aktivität in in vitro und gezeigt hat, <em> In vivo-Studien 1. Es hat sich gezeigt, dass Ultraschall bevorzugt Schäden malignen Zellen basierend auf der Größe Differenz zwischen solchen Zellen und denen der normale Histologie 1,5. SDT enthält spezielle Wirkstoffe wie sonosensitizers um das Ausmaß der durch Ultraschall gegen Tumorzellen ausgeübt Vorzugs Schäden erhöhen bekannt. Während therapeutische Anwendungen von SDT wurden zuvor untersucht worden, Ultraschallsystemen verwenden typischerweise höhere Frequenz Ultraschall (≥1 MHz), und die Auswirkungen der niedrigen kHz Frequenzultraschall ist noch nicht vollständig erforscht. Niedrigere Frequenzen von Ultraschall sind oft auf die Herstellung Inertial Kavitation, ein Phänomen, das in der Zerstörung von Zellen führt zu mehr beherrschen aufgrund der schnellen Kollabieren der Mikrobläschen, induzieren physikalisch Schaden 12-14. Dieser Unterschied in der Erzeugung des Inertial Kavitation zwischen MHz und niedriger kHz Ultraschall hat, dass untere Wellenfrequenzen ermöglichen Mikroblasen zugeschriebens mehr Zeit, um durch gleichgerichtete Diffusion in den Ausbau Halbzyklus während der folgenden Kompressionshalbwelle 12 wachsen, damit die Herstellung heftiger Zusammenbrüche.
Wir haben zuvor gezeigt, dass U937 humanen monozytären Leukämie-Zellen empfindlich gegenüber niederfrequenten Ultraschall (23,5 kHz) ist, und dass diese Empfindlichkeit kann deutlich durch die Anwendung von antineoplastischen Mitteln, die das Zytoskelett 15 stören erhöht werden. Ferner haben wir gezeigt, dass Zellen beschädigt werden vorzugsweise anhand von Größe, mit größeren Zellen, die eine höhere Ultraschallempfindlichkeit. Außerdem sind normale menschliche hämatopoetische Stammzellen (hHSCs) und Leukozyten bei vergleichbaren Zellgrößen wesentlich beständiger gegen Beschallung als ihre Pendants neoplastischen 15 vorläufig darauf hindeutet, dass Niederfrequenz-Ultraschall kann verwendet werden, um bösartige Zellen zu beschädigen bevorzugt in Gegenwart von normalem Gewebe.
Zur weiteren Untersuchung der einzigartigen propschaften von Niederfrequenz-Ultraschall für mögliche therapeutische Anwendung haben wir Reinigungs- und Stabilisierungsverfahren entwickelt, um die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit einer unserer aktuellen Beschallungssystemen zu erhöhen, die Branson Modell SLPE 150 W, 40 kHz Zellaufschlussgerät, mit einem 20 mm Horn ausgestattet ausgestattet in einen 7,62 cm Tasse. Darüber hinaus haben wir in der Lage, genaue Proben Kavitation Energien sowie konsequente Wellenformen und Amplituden innerhalb der 40 kHz-Bereich mit einer Kavitation Meter und Oszilloskop mit Hydrophon zu bestimmen. Durch Raffination und Systematisierung unserer Protokolle, konnten wir die Konsistenz in unsere experimentellen sonications etablieren, so dass wir quantitativ vergleichen die sonic Empfindlichkeit von Tumorzellen und normalen Zellen verschiedener histogenetischen Abstammungslinien. Unser Protokoll für die 40 kHz-System wird in umfangreichen Detail, um für interessierte Laboratorien der Lage ist, vergleichbare Experimente zu sein und unsere Ergebnisse der antineoplastischen Wirkungen durch ausgelöst bewerten vorgestelltNiederfrequenz-Ultraschall. Außerdem prüfen wir die dosisabhängige Wirkung von Methyl-β-Cyclodextrin (MeβCD; Abbildung 1), einen Cholesterin-abbauende Mittel, auf die Erhöhung der Empfindlichkeit des Ultraschall U937 und THP1 menschliche monozytäre Leukämie-Zellen.
Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten Sie besonders vorsichtig, sorgfältig zu positionieren, die Probe und reinigen Sie die Konverter-horn Union. Das Platzieren des Musters in dem Horn ist wichtig für den Erhalt von konsistenten Zellzerstörung als Veränderung des Abstands von der Hupe des akustischen Brennpunkten zu ändern, und deshalb verändern die Energie, die der Probe ausgesetzt ist. Die akustische Energie innerhalb des Bechers Horn kann mit der Kavitation Messer, um die Position der maximalen Kavitation finden abgebildet werden. Darüber hinaus sind die Kavitation Messer zusammen mit dem Oszilloskop von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung der Schallintensität der Zellen, die zu belichtende sowie die Homogenität der Wellenform. Deshalb sollten diese Instrumente verwendet werden, um Probleme mit dem System zu erfassen, und um festzustellen, was zur Fehlerbehebung benötigt werden, um Systeminstabilität zu korrigieren werden.
Wie bereits erwähnt, kann die Niederfrequenzsystem zur weiteren Entgasung während des Experiments, wenn nicht für das Wasser laufen zu handelnEinige Minuten vor der Ultraschallbehandlung zu probieren. Dieser Initiallauf durchgeführt werden muss, um eine relativ entgast Beschallung Medium und damit konsistente Ergebnisse bei Versuchen ergeben. Zusätzlich können Zellen, sollte nicht bei oder nahe der maximalen Amplitude bei der Beurteilung der Wirksamkeit von sonosensitizers, da das wahre Ausmaß der Sensibilisierung wäre schwierig zu beurteilen, beschallt werden. Verwenden von 33% Amplitude auf der 40 kHz-System ist ein idealer Ort, da es bemerkenswerte Schäden produziert, aber bietet sonosensitizers reichlich Platz, um ihre Wirksamkeit zu demonstrieren, wie mit MeβCD gegen U937 und THP1 Zellen (Abbildung 7) gezeigt. Diese Daten bestätigen, dass MeβCD sensibilisiert mehrere Leukämie Leitungen Niederfrequenz-Ultraschall in einer dosisabhängigen Weise.
Es wurden eine Reihe von Experimenten mit einer höheren Frequenz im Bereich von 0,75 MHz bis 8 MHz die Anzeichen von Intra Kavitationsblasen geführt wird durch Beschallung 17-19 erzeugt. Allerdings questions immer noch in Bezug auf die genaue Mechanismus der Ultraschall-induzierte Zelllyse 18 verbleiben. Wir haben einen Zusammenhang zwischen Wirbel das Zytoskelett gezeigt und unter Verwendung niederfrequenter Ultraschall 15, ein Phänomen, das von anderen Laboratorien 20 zeigten erhöhte Schallempfindlichkeit 21. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Mikrofilament-stören Mittel wie Cytochalasin B potenzieren Ultraschallempfindlichkeit in mehreren Leukämie Linien, aber nicht hHSCs oder Leukozyten 22, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der Aktin-Polymerisation kann ein sonosensitizing Mechanismus von besonderem Interesse sein. Wir haben auch beobachtet, dass Vincristin, ein Mikrotubuli-unterbrechenden Substanzen, die Tubulin-Polymerisation 23, 24 verhindert, deutlich erhöht die Ultraschallempfindlichkeit verschiedener Leukämietypen in vitro einschließlich akute myeloische Leukämie, chronische myeloische Leukämie und akute lymphatische Leukämie. Dagegen Zytoskelett-gerichtete Mittel, die Zytoskelett-Komponenten zu stabilisieren (Paclitaxel eind Jasplakinolid) erscheinen Zellen resistent gegenüber Ultraschallbehandlung, durch niedrigere Zelllyse 22 reflektiert zu machen. Zusammengenommen zeigen diese Daten die Hypothese, dass die Komponenten des Cytoskeletts von neoplastischen Zellen Fluidisierung ist in der Tat ein wichtiger Faktor bei der Erhöhung der Wirksamkeit von SDT 25. Die vorliegende Studie zeigt auch, dass Cholesterinabbau kann ein anderes Verfahren, mit dem weiteren potenzieren die Ultraschall Empfindlichkeit neoplastischer Zellen, wie MeβCD behandelten U937 Zellen merklich zu 40 kHz Ultraschall sensibilisiert werden.
Während unsere Beschallung Protokolle deutliche antineoplastische Aktivität in vitro gezeigt, wird die aktuelle Methode auf die Verwendung in der Kultur und kleinen Wirbeltiermodelle, die in der Lage, in den für die Beschallung verwendeten Phiolen passen zu arbeiten. Wir haben gezeigt, daß Zebrafisch kann sicher mittels gepulster niederfrequenter Ultraschall (20 kHz) mit Ultraschall behandelt werden gezeigt, und dass ihre Toleranz gegenüber Chemotherapeutika sind quantitativ vergleichbarDosen von murinen Modellen 26 toleriert, was darauf hindeutet, dass die Tumor-tragenden Zebrafisch in vorläufigen Untersuchungen verwendet, um die in vivo antineoplastische Aktivität dieser Protokolle zu beurteilen. Dennoch Verabreichung chemotherapeutische Mittel vor dem Beschallen von Säugetiermodellen hat im MHz-Bereich 1 berichtet worden, und solche Protokolle können wahrscheinlich erweitert niederfrequenter Ultraschall, sowie Cholesterin-abbauenden und Zytoskelett-gerichtete Mittel einzuarbeiten.
Potentielle klinische Anwendungen dieser Form kann es sich um SDT extrakorporalen Blut Beschallung in dem antineoplastischen Mittel werden intravenös (iv) vor dem Blut, die für Ultraschallbehandlung 25 entfernt. Diese Methode entfernt potenziellen Lärmschutzwände durch die menschliche Anatomie gestellt und kann ein wirksames Mittel, um Leukämiezellen sowie Metastasen von soliden Tumoren zu beschädigen. Es ist auch möglich, dass Cholesterin abbauenden und Zytoskelett gerichtete Agenten könntenin HIFU-Protokolle, die bereits in der Klinik, in einem Versuch, um die Wirksamkeit dieser Behandlungsmodalität verbessern sucht werden, verwendet werden.
Die in der vorliegenden Studie beschriebenen Verfahren sind in der Lage, der Bewertung von potenziellen sonosensitizers und weitere System Verfeinerung kann dieses Dienstprogramm zu verbessern. Allerdings gibt es viele Variablen, um bei der Verwendung solcher Ultraschall entwirft, einschließlich Stromversorgungsqualität, Akustik Brennpunkte, und individuelle Unterschiede zwischen den Wandlern zu berücksichtigen. Daher wird die zukünftige Forschung auf die Visualisierung der Schallwellen und das Verständnis ihres Einflusses auf Ergebnisse zu konzentrieren. SDT gezeigt Zelllyse in vitro zu verbessern und kann sich als klinisch brauchbare wenn mehr in-vivo-Daten in Säugermodellen erfasst werden zu können. Experimenten, die andere potenziell nutzbaren Eigenschaften von malignen Zellen, sowie verschiedene kombinierte Modalitäten mit mehreren Agenten und Ultraschall weiter in unserem Labor.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |