Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
O ultra-som refere-se a qualquer onda de pressão acústica com uma frequência de oscilação maior do que o limite superior das capacidades auditivas humanas (~ 20 kHz) 1. Ultra-som de baixa frequência na gama de 20-60 kHz foi utilizada no laboratório como um meio de produção de emulsões, preparando amostras celulares para a extracção de ácido nucleico, por rompimento do tecido, e para uma variedade de outros testes. O utilitário de ultra-som de baixa freqüência também foi estendido para o ambiente industrial para soldagem, limpeza diversos materiais, e no processamento de materiais. Comercialmente geradores de ultrassons disponíveis vêm em freqüências que variam 18-60 kHz, e em grande escala de potências 100-1,200 W.
Apesar do ultra-som tem sido muito utilizado na prática clínica para a imagiologia de diagnóstico, que tem sido aplicada como uma modalidade terapêutica apenas recentemente. Ultrasound ≥1 MHz é capaz de perturbar de forma segura cálculos urinários (pedras nos rins) e cálculos biliares (pedras em the vesícula biliar ou no fígado) em pacientes para reduzir os sintomas 2,3. Esta abordagem conhecida como litotripsia extracorpórea por ondas de choque (LECO) é hoje amplamente aplicada na clínica (mais de um milhão de pacientes são tratados anualmente com LECO nos Estados Unidos sozinho 4), e oferece uma modalidade pela qual a não-invasiva quebrar cálculos com danos colaterais mínimos, através da utilização de impulsos acústicos aplicados externamente, centrada, de alta intensidade 2-4.
Devido às forças directas originais de cisalhamento, bem como bolhas de cavitação ultra-sons gerados por alta intensidade, estas metodologias foram examinados em terapia do cancro para o tratamento de carcinoma da próstata resistente à castração e adenocarcinoma pancreático em uma abordagem conhecida como concentrado de alta intensidade ultra-som (HIFU ) 8/5. De um modo muito semelhante ao LECO, HIFU utiliza múltiplos feixes de ultra-som e concentra-los numa área focal seleccionada para gerar temperaturas de 60 ° C ou hig-a através da utilização de energia acústica, induzir necrose coagulativa no tecido alvo 5. Embora outras modalidades de ablação térmica existem atualmente (ablação por radiofreqüência e ablação por microondas), HIFU oferece uma vantagem distinta sobre esses métodos em que é a única modalidade hyperthermic não-invasivo 5. HIFU tem alcançado resultados mistos na clínica e está atualmente disponível apenas em ensaios clínicos 11/08. No entanto, o sucesso limitado que alcançou, eo muito promissor dados in vivo adquiridos a partir de modelos pré-clínicos de mamíferos têm demonstrado o potencial do ultra-som na terapia do cancro.
Num esforço para melhorar HIFU, os investigadores tentaram combinar com agentes antineoplásicos de ultra-sons apropriadas para gerar uma forma de sonochemotherapy. Terapia Sonodynamic (SDT) é uma modalidade de tratamento novo promissor que tem demonstrado actividade antineoplásica em impressionante tanto in vitro como <em> Estudos in vivo um. Tem sido demonstrado que o ultra-som preferencialmente danos células malignas baseados no diferencial de tamanho entre essas células e os da histologia normal 1,5. SDT incorpora agentes especializadas conhecidas como sonosensitizers para aumentar a extensão do dano preferencial exercida por ultra-sons contra células neoplásicas. Enquanto as aplicações terapêuticas da SDT foram previamente examinados, sistemas ultra-sônicos utilizados normalmente empregam mais elevado de ultra-som de frequência (≥1 MHz), e os efeitos do ultra-som de baixa frequência kHz ainda não foi totalmente explorado. Menores freqüências de ultra-som são muitas vezes mais eficientes na produção de cavitação inercial, um fenômeno que resulta na destruição das células devido ao rápido colapso de microbolhas, induzindo dano físico 12-14. Esta diferença na geração de cavitação inercial entre MHz baixo e ultra-som kHz tem sido atribuída ao facto de as frequências de onda inferiores permitir microbolhass mais tempo para crescer por difusão corrigida no meio ciclo de expansão, consequentemente, a produção de colapsos mais violentos durante o meio ciclo seguinte de compressão 12.
Nós já demonstrado que as células monocíticas humanas U937 de leucemia são sensíveis à ultra-som de baixa frequência (23,5 kHz), e que esta sensibilidade pode ser significativamente aumentada através da aplicação de agentes anti-neoplásicos que perturbam o citoesqueleto 15. Além disso, demonstrámos que as células são preferencialmente danificado com base no tamanho, com células maiores que apresentam uma sensibilidade mais elevada de ultra-sons. Além disso, as células normais humanas estaminais hematopoiéticas (hHSCs) e leucócitos em tamanhos de células comparáveis são muito mais resistentes a sonicação do que os seus homólogos neoplásicas 15, que poderá sugerir que o ultra-som de baixa frequência pode ser utilizado para danificar as células malignas, preferencialmente, na presença de tecido normal.
Para examinar ainda mais a prop exclusivoerties de ultra-som de baixa frequência para o potencial uso terapêutico, desenvolvemos procedimentos de limpeza e estabilização para aumentar a eficácia ea confiabilidade de um de nossos sistemas de sonicação atuais, a 150 W Branson Modelo SLPE, 40 kHz Disrupter celular, equipado com um chifre de 20 milímetros equipada em um copo de 7,62 centímetros. Além disso, temos sido capazes de determinar precisos energias amostra de cavitação, bem como formas de ondas consistentes e amplitude dentro da faixa de 40 kHz usando um medidor de cavitação e osciloscópio com hidrofone. Refinando e sistematizar nossos protocolos, temos sido capazes de estabelecer uma coerência em nossos sonicações experimentais, o que nos permite comparar quantitativamente as sensibilidades sônicas de células neoplásicas e normais de diferentes linhagens de histogênese. Nosso protocolo para o sistema de 40 kHz é apresentado em grande pormenor, a fim de laboratórios interessados para ser capaz de realizar experiências comparáveis, e para avaliar os resultados dos efeitos antineoplásicos eliciados porultra-som de baixa freqüência. Além disso, nós examinamos os efeitos dependentes de dose de metil-β-ciclodextrina (MeβCD; Figura 1), um agente de empobrecimento do colesterol, no aumento da sensibilidade de ultra-sons de células U937 e células THP1 de leucemia monocítica humana.
Para alcançar melhores resultados, deve-se tomar cuidado especial para posicionar cuidadosamente a amostra e limpar a união conversor de-chifre. A colocação da amostra no corno é importante para se obter a destruição de células consistentes, como a mudança da distância do chifre irá alterar os focos acústico, e, por conseguinte, alterar a energia a amostra está exposta. A energia acústica dentro do chifre copo pode ser mapeada usando o medidor de cavitação para encontrar a posição de máxima cavitação. Além disso, o medidor de cavitação, junto com o osciloscópio são vitais para a determinação da intensidade sonora as células estão a ser expostos, assim como a homogeneidade da forma de onda. Portanto, estes instrumentos devem ser utilizados para detectar problemas com o sistema, e ajudar a determinar a resolução de problemas que podem ser necessárias para corrigir a instabilidade do sistema.
Como mencionado anteriormente, o sistema de baixa frequência pode actuar para mais desgaseificar a água ao longo da experiência não se correr paravários minutos antes da amostra sonicação. Este prazo inicial deve ser realizada para produzir um meio de ultra-sons relativamente desgaseificado e resultados assim consistentes durante as experiências. Além disso, as células não devem ser sonicada a ou perto da amplitude máxima quando se avalia a eficácia das sonosensitizers, como a verdadeira medida da sensibilização seria difícil de avaliar. Usando 33% amplitude no sistema kHz 40 é um cenário ideal, uma vez que produz danos notáveis, mas fornece sonosensitizers amplo espaço para demonstrar a sua eficácia, como ficou demonstrado com MeβCD contra U937 e células THP1 (Figura 7). Estes dados também confirmam que sensibiliza MeβCD várias linhas de leucemia a partir de ultra-sons de frequência de um modo dependente da dose.
Tem havido um grande número de experiências feitas com maior frequência na gama de 0,75 MHz a 8 MHz mostrando evidência de bolhas de cavitação intramembranar ser gerado através de ultra-sons 17-19. No entanto, questioNS ainda permanecem no que diz respeito ao mecanismo exato de induzida por ultra-som lise celular 18. Nós têm mostrado uma ligação entre o citoesqueleto fluidificação e aumento da sensibilidade sonora usando o ultra-som de baixa freqüência de 15, um fenômeno demonstrado por outros laboratórios 20, 21. Além disso, verificou-se que os agentes de perturbação microfilamentosas como citocalasina B potenciar a sensibilidade ultra-som na leucemia múltiplo linhas, mas não hHSCs ou leucócitos 22, sugerindo que a inibição da polimerização da actina podem ser um mecanismo de sonosensitizing de particular interesse. Observamos, também, que a vincristina, um agente de interrupção dos microtúbulos, que inibe a polimerização da tubulina de 23, 24, aumenta significativamente a sensibilidade de ultra-sons de diferentes tipos de leucemia in vitro, incluindo a leucemia mieloide aguda, leucemia mielóide crónica e leucemia linfóide aguda. Por contraste, agentes dirigida ao citoesqueleto que estabilizam os componentes do citoesqueleto (paclitaxel umd jasplaquinolida) parecem tornar as células resistentes a ultra-sons, refletida por baixas taxas de lise celular 22. Tomados em conjunto, estes dados suportam a hipótese de que os componentes do citoesqueleto de fluidização de células neoplásicas é de facto um factor importante para aumentar a eficácia do SDT 25. O presente estudo também demonstra que a depleção de colesterol pode ser um outro método que permite potenciar ainda mais a sensibilidade de ultra-sons de células neoplásicas, tal como células U937 tratadas com MeβCD são marcadamente sensibilizados a 40 kHz de ultra-som.
Enquanto os nossos protocolos de sonicação têm demonstrado actividade antineoplásica significativa in vitro, a metodologia corrente é limitada para trabalhar em modelos de cultura de vertebrados e pequena, que são capazes de encaixar nos frascos utilizados para a sonicação. Mostrámos que peixe-zebra pode ser ultra-sons pulsada com segurança usando ultra-som de baixa frequência (20 kHz), e que a tolerância aos agentes quimioterapêuticos é quantitativamente comparáveis aosDoses toleradas por modelos murinos 26, sugerindo que a peixe-zebra que possui o tumor pode ser usado em investigações preliminares para avaliar a actividade anti-neoplásica in vivo destes protocolos. No entanto, a administração de agentes quimioterapêuticos antes da sonicação de modelos de mamíferos tem sido relatado na gama de 1 MHz, e tais protocolos pode provavelmente ser estendido para incorporar baixa frequência do ultra-som, bem como o colesterol de empobrecimento e agentes dirigida ao citoesqueleto.
Potenciais aplicações clínicas desta forma de SDT pode envolver sonicação sangue extracorporal em que os agentes antineoplásicos são administrados por via intravenosa (iv) antes de o sangue a ser removido por ultra-sons 25. Esse método remove barreiras de som potenciais colocados pela anatomia humana, e pode ser uma maneira eficaz para danificar blastos leucêmicos, assim como metástases de tumores sólidos. É também possível que o colesterol de empobrecimento e agentes dirigida-citoesqueleto poderiaser utilizado em protocolos de HIFU que já estão a ser examinadas na clínica, numa tentativa de melhorar a eficácia deste tipo de tratamento.
Os métodos descritos no presente estudo são capazes de avaliar o valor de potenciais sonosensitizers e aperfeiçoamento do sistema pode melhorar este utilitário. No entanto, há muitas variáveis a serem consideradas ao usar esses legados de ultra-som, incluindo a qualidade da fonte de alimentação, focos acústico, e variação individual entre os conversores. Portanto, futuras pesquisas incidirá sobre visualizando as ondas sonoras e entender sua influência nos resultados. SDT tem mostrado melhorar a lise celular in vitro, e podem vir a ser clinicamente viável se mais dados in vivo em modelos de mamíferos são adquiridas. Experiências examinando outras características de potencial risco de células malignas, bem como várias modalidades combinadas envolvendo múltiplos agentes de ultra-sons e continuar no nosso laboratório.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |