Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
초음파는 인간의 청각 능력의 상한보다 큰 주파수 (~ 20 kHz에서) 한 어떠한 진동 음압 파를 말한다. 20-60 kHz의 범위에서 저주파 초음파는 조직 파쇄, 핵산 추출을 위해 세포 시료를 조제 에멀젼을 생성하는 수단으로 실험실에서 이용하고, 다른 시험 다양한되었다. 저주파 초음파의 유틸리티는 다양한 재료를 청소, 용접 산업 설정을 확장하고, 재료 처리되었습니다. 시판 초음파 발생기는 100-1,200 W.에서 램프 전력을 18-60 kHz의 범위의 주파수에 와서 본격적인
초음파가 긴 진단 이미징을위한 임상에 사용 하였지만, 그것은 단지 최근 중요한 요법으로서 적용되었다. 초음파 ≥1 MHz의 일에 안전하게 요로 결석 (신장 결석) 및 담도 결석을 방해 (돌 수있다환자의 전자 담낭이나 간에서)의 증상 2,3를 줄일 수 있습니다. 체외 충격파 쇄석술 (ESWL)로 알려진이 방법은 널리 병원 (백만 명 이상의 환자가 혼자 미국에서 ESWL으로 매년 4 처리)에 적용하고, 양상을 제공을하는 비 침습적으로 결석을 분해한다 외부 적으로 적용, 집중, 높은 강도 음향 펄스 2-4의 사용을 통해 최소한의 부수적 인 피해.
때문에 높은 강도의 초음파에 의해 생성 된 고유 직접 전단력뿐만 아니라, 캐비테이션 버블에, 이들 방법론이 고강도로 알려진 접근법에서 거세 저항 전립선 암 및 췌장 선암의 치료를위한 암 치료에서 조사 된 집속 초음파 (HIFU ) 5-8. ESWL 매우 유사한 방식으로, 여러 HIFU 초음파 빔을 사용하고, 60 ° C 또는 HIG의 온도를 생성하도록 선택된 초점 영역에 초점을 맞추고 그들을그녀 표적 조직 5 응고 괴사를 유도하는 음향 에너지의 사용을 통해. 열 제거의 다른 양식은 (고주파 열 치료 및 마이크로 웨이브 절제) 존재하지만, HIFU는 유일한 비 침습적 온열 양상 5 인 것을 이러한 방법에 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. HIFU는 병원에서 혼합 된 결과를 달성하고 현재 임상 시험 8-11에서만 사용할 수있다. 그럼에도 불구하고,이 달성 제한된 성공 및 전임상 포유 동물 모델에서 얻은 생체 데이터는 매우 유망한 암 치료 초음파의 가능성을 증명 하였다.
HIFU를 개선하기 위해, 연구자 sonochemotherapy의 형태를 생성하는 데 적합한 항신 생물 제와 초음파를 결합하려고 시도했다. Sonodynamic 치료 (SDT)는 체외에서 모두 인상적인 항 종양 활성을 보여 주었다 유망한 새로운 치료 방법입니다 <em> 생체 연구 1. 그것은 손해를 우선적으로 이러한 세포와 정상 조직 학적 1,5의 그 사이의 크기 차이를 기반으로 악성 세포를 그 초음파를 보였다. SDT는 종양 세포에 의해 가해진 초음파 우선적 손상 정도를 증가 sonosensitizers 알려진 전문 에이전트를 포함한다. SDT의 치료 프로그램이 이전 검토되었지만, 사용되는 초음파 시스템은 일반적으로 높은 주파수의 초음파 (메가 헤르츠 ≥1)을 사용하고, 낮은 주파수 kHz의 초음파의 영향은 아직 완전히 탐구한다. 초음파의 낮은 주파수에 의한 물리 화학적 손상 12-14을 유도 마이크로 버블의 급격한 붕괴에 자주 관성 캐비테이션, 세포의 파괴를 초래하는 현상을 생산에 더 능숙하다. MHz 및 저 kHz의 초음파 간의 관성 캐비테이션의 발생의 차이가 낮은 전파는 주파수 미세 기포를 사용한다는 사실에 기인 한다음 압축 하프 사이클 12 동안에 따라서 더 강력한 붕괴 제조, 팽창 하프 사이클에서 정류 된 확산에 의해 성장하는 데 더 많은 시간이야.
우리는 이전에 U937 인간 단핵구 백혈병 세포가 저주파 초음파 (23.5 kHz에서)에 민감한 것으로 나타났습니다, 그리고이 감도는 크게 세포 골격 (15)를 교란 항 종양 제의 적용을 통해 증가시킬 수있다. 또한, 우리는 세포가 우선적으로 더 높은 초음파 감도를 나타내는 큰 세포, 크기에 따라 손상된 것을 증명하고있다. 또한, 비교 셀 크기에 정상적인 인간 조혈 줄기 세포 (hHSCs)과 백혈구 잠정적 저주파 초음파 우선적 정상 조직의 존재하에 종양 세포를 손상하는 데 사용될 수 있음을 시사 그들의 생물 대응 15보다 초음파 처리에 더 내성이다.
더 독특한 소품을 검사하려면잠재적 인 치료 용도를위한 저주파 초음파 erties, 우리는 우리의 현재 초음파 시스템 중 하나의 효능 및 안정성을 증가시키기 위해 세정 및 안정화 과정을 개발, 20mm 혼 구비 브랜슨 모델 SLPe 150 W, 40 kHz의 셀 교란이 끼워 7.62 CM 컵에. 또, 하이드로와 캐비테이션 미터 및 오실로스코프를 사용하여 40 kHz의 범위 내에서 정확한 샘플 캐비테이션 에너지뿐만 아니라 일관성 파형과 진폭을 결정할 수 있었다. 정제 및 우리의 프로토콜을 체계화함으로써, 우리는 우리가 정량적으로 다른 histogenetic 계통의 종양과 정상 세포의 음향 감도를 비교 할 수 있도록, 우리의 실험 sonications의 일관성을 확립 할 수 있었다. 40 kHz의 시스템에 대한 우리의 프로토콜은 관심이 실험실의 순서를 비교 실험을 수행 할 수 있어야하고,에 의해 유발 항 종양 효과의 우리의 연구 결과를 평가하기 위해 광범위한 상세하게 제시저주파 초음파. (도 1 MeβCD), 콜레스테롤 파괴 제, U937의 초음파 감도와 THP1 인간 단핵구 백혈병 세포의 증가에 더하여, 우리는 메틸 – β – 시클로 덱스트린의 농도 의존적 효과를 검토한다.
최적의 결과를 달성하기 위해 특별한주의가 신중하게 샘플을 놓고 컨버터 혼 노조를 청소주의해야한다. 호온의 샘플 위치는 혼으로부터 거리를 변경하는 것은 샘플이 노출되는 에너지를 변경할 수 있으므로 탄성 초점을 변경 한 바와 같이, 일치 셀의 파괴를 얻기 위해 중요하다. 컵 호른 내의 음향 에너지는 최대 캐비테이션의 위치를 찾기 위해 캐비테이션 미터를 사용하여 매핑 될 수있다. 또한, 오실로스코프와 함께 캐비테이션 m은, 세포에 노출되는 소리의 강도뿐만 아니라, 파형의 균질성을 결정하기에 매우 중요하다. 따라서 이러한 장비는 시스템에 문제를 감지하고 문제 해결에 시스템 불안정을 해결하기 위해 필요할 수있다을 결정하는 데 도움이되어야한다.
앞서 언급 한 바와 같이, 저주파 시스템에 대해 실행되지 않을 경우 상기 실험 내내 탈기 물 작용할 수도초음파를 샘플링하는 데 몇 분 전에. 이 초기 실행은 실험 기간 동안 상대적으로 탈기 초음파 매체 따라서 일관성있는 결과를 산출하기 위해 수행해야합니다. 감작의 진정한 범위는 평가하기 어렵다 같이 sonosensitizers의 효능을 평가하는 경우뿐만 아니라, 세포에서 또는 근처에서 최대 진폭 초음파 처리되어서는 안된다. 40 kHz의 시스템에서 33 %의 진폭을 사용하는 것은 주목할만한 손상을 생산하는 등의 이상적인 설정이지만, U937과 THP1 세포 (그림 7)에 대해 MeβCD으로 입증 된 바와 같이, 그 효능을 입증하는 sonosensitizers 충분한 공간을 제공합니다. 이러한 데이터는 또한 MeβCD이 용량 의존적으로 저주파 초음파 여러 백혈병 라인을 민감하게 확인합니다.
초음파 분해를 통해 생성되는 17-19 intramembrane 캐비테이션 기포의 증거를 나타내는 8 MHz의 0.75 MHz의 주파수 범위 내에서 더 높은 빈도로 수행 실험있어왔다. 그러나 questio여전히 초음파 – 유도 된 세포 용해 (18)의 정확한 메커니즘에 관해서 남아 NS. 우리는 저주파 초음파 (15), 다른 실험실 20 입증 현상을 이용하여 세포 골격 유동화 사이의 링크를 도시하고 소닉 감도를 증가하고있다 (21). 또, 이러한 사이토 B로서 미사 교란 에이전트가 여러 백혈병 초음파 감도를 강화시킬 수 있음을 발견 하였다 액틴의 중합 반응의 억제를 제안 라인,하지만 hHSCs 또는 22 백혈구, 특히 관심이 sonosensitizing 메커니즘 수있다. 또한 현저 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프 성 백혈병을 포함한 시험 관내 백혈병 다른 종류의 초음파의 감도를 증가시킨다, 즉 빈 크리스틴, 튜 불린 중합에 23, 24을 억제 미세 소관 붕괴 제를 관찰했다. 대조적으로, 세포 골격 성분을 안정화 골격 지시 제 (파클리탁셀D의 jasplakinolide)는 세포 용해 (22)의 낮은 가격으로 반영, 초음파에 세포를 방지하기 위해 나타납니다. 종합 해 보면, 이러한 데이터는 종양 세포의 세포 골격 성분을 유동화 가설 실제로 SDT (25)의 효능을 높이는 중요한 요소이다 지원한다. 본 연구는 또한 콜레스테롤 고갈 MeβCD 처리 된 U937 세포가 현저하게 40 kHz에서 초음파에 민감로 추가로, 종양 세포의 초음파 감도를 강화시킬 수있는 또 다른 방법이 될 수 있음을 보여줍니다.
우리의 초음파 프로토콜 체외에서 현저한 항 종양 활성을 증명하고 있지만, 현재의 방법은 초음파에 사용되는 유리 병에 맞게 할 수있는 문화와 작은 척추 동물 모델에서 작동하도록 제한된다. 우리는 안전하게 펄스 저주파 초음파 (20 kHz에서)를 사용하여 초음파 처리 할 수있는 제브라 피쉬를 보여 주었다, 및 화학 요법 제에 자신의 허용 오차를 정량적으로 비교입니다그 담암 제브라 제안 뮤린 모델 (26)에 의해 허용 투여 량은 이들 프로토콜의 생체 내 항 종양 활성을 평가하기위한 예비 조사에 사용될 수있다. 그럼에도 불구하고, 종래 포유 동물 모델의 초음파로 화학 요법 제를 투여하는 것은 MHz의 범위 (1)에보고되어 있으며, 이러한 프로토콜은 예상 저주파 초음파뿐만 아니라 콜레스테롤 파괴 및 세포 골격 – 지향 제를 포함하도록 확장 될 수있다.
SDT 이런 형태의 잠재적 인 임상 응용 프로그램은 항 종양 제를 정맥 투여 (IV) 혈액에 앞서이 초음파 (25) 제거되고있는 혈액의 체외 초음파를 포함 할 수있다. 이 방법은 인체 해부학로 인한 잠재적 인 사운드 장벽을 제거하고, 고형 종양에서 백혈병 모세포뿐만 아니라 전이를 손상시킬 수있는 효과적인 방법 일 수있다. 그것은 그 콜레스테롤 파괴 및 세포 골격 지시 에이전트가 할 수 있었던 것도 가능하다이미이 치료 방법의 효능을 개선하기위한 시도는 병원에서 시험되고 HIFU 프로토콜에서 사용될.
본 연구에 기재된 방법이 유틸리티를 향상시킬 수있는 잠재력 sonosensitizers의 값 및 상기 시스템을 평가 정제 할 수있다. 그러나, 전원의 품질, 탄성 초점 및 컨버터 중 개인차 포함한 초음파 심지를 사용할 때 고려 될 수있는 많은 변수가있다. 따라서, 향후 연구는 음파를 시각화하고 결과에 미치는 영향을 이해에 초점을 맞출 것이다. SDT는 체외에서 세포 용해를 향상시키기 위해 표시하고 취득 포유 동물 모델에서 생체 데이터에 더 많은 경우 임상 적으로 가능한 것을 입증 할 수있다. 여러 에이전트와 초음파를 포함하는 악성 세포의 다른 잠재적으로 악용 특성뿐만 아니라 다양한 결합 된 양상을 조사 실험은 우리 실험실에서 계속합니다.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |